一、抗體親和純化

純化抗體的方法多種多樣，其選擇取決于后續應用、來源種類、免疫球蛋白(Ig)類別和亞類以及起始材料的來源。認識到沒有一種單一的方法可以滿足所有應用的需求是很重要的，但是本文中詳細介紹了適用于大多數IgG純化的常用方法。為了最大限度地純化IgG，我們利用高容量IgG結合特異性細菌蛋白固定在固相載體上，如瓊脂糖凝膠或瓊脂糖磁珠。用于純化抗體的細菌蛋白，如(1)來自金黃色葡萄球菌的Protein A，(2)來自鏈球菌的Protein G，(3)來自大胃鏈球菌的Protein L。每一種蛋白都具有獨特的Ig結合特性，如表1所示，可用于從各種基質如血清、培養上清液或腹水中純化抗體。

表1   protein-A, protein-G, and protein-L的抗體結合特性

多克隆抗體經常作為從免疫動物血液中獲得的抗血清提供。原抗血清含有大量干擾免疫測定的外源蛋白，常用Protein A或Protein G來清除大量不需要的血清蛋白。抗血清中還含有大量針對非抗原靶的有害抗體(>95%的總IgG)，而這些非特異性的Ig蛋白并沒有被這種純化方法去除。單克隆抗體通常作為雜交瘤培養上清或接種雜交瘤細胞系后從小鼠腹腔內收集的腹水提供。與多克隆抗血清相似，單克隆抗體可以通過Protein A或Protein G的方法純化，但與抗血清不同的是，在粗產物中存在的大多數免疫球蛋白都是針對靶抗原的單一類/亞型。Protein L通常可以替代ProteinA或Protein G，我們利用其不能與牛IgG結合的優勢，從混入胎牛血清的雜交瘤培養上清中純化小鼠IgG。表2給出了這三種抗體結合蛋白對不同物種IgG類型的相對結合親和力。由于Protein A或Protein G都不能結合雞來源的IgY抗體，所以只能用Protein L純化雞來源的IgY抗體。在純化前，應在適當的緩沖液中稀釋粗抗血清和腹水，以調整結合pH值，并盡量減少體積蛋白負載效應，從而阻止所需的抗體與固相載體的結合。

表2   protein-A, protein-G, andprotein-L對不同種屬抗體的相對親和能力

二、“四大名捕”升級“五大名捕”

1. Protein A

從原核金黃色葡萄球菌細胞壁分離的結合受體Protein A(~56kDa)與不同免疫球蛋白同型的Fc區以及人V_H3家族的Fab區具有高度的親緣關系。進一步研究表明，Protein A僅限于與IgG亞類IgG₁、IgG₂和IgG₄結合，與IgG₃的反應性很低，約占總IgG的8%。天然的Protein A有5個IgG結合結構域和未知功能的非Fc結合域，結構示意圖如下：

圖1   Protein A的結構域示意圖

此結構的ProteinA大量結合IgG的同時，其非Fc結合域能結合部分雜蛋白，導致洗脫下來的IgG純度不夠，因此科學家利用基因工程的方法克隆Protein A的基因并進行改造，得到重組型Protein A，其非特異性結合明顯降低。重組的Protein A經過改造后有一個C端的半胱氨酸，可以單點偶聯到瓊脂糖凝膠和瓊脂糖磁珠上，降低空間位阻的同時提高IgG的結合能力。一步親和層析后樣品純度可超過90%。

2. Protein G

Protein G是一種源自鏈球菌G族的細胞壁蛋白，分子量25kDa，為三型Fc受體。Protein G可與IgG的Fc區域特異性結合，與Protein A相比對IgG具有更好的結合能力，血清蛋白結合水平更低，純度更高，配基脫落也相對更低。天然的ProteinG還能與大多數物種（包括大鼠和山羊）的免疫球蛋白結合，并能識別大多數類和亞類。雖然Protein G與蛋白白蛋白也有很高的親和性，這可能會導致污染問題。重組Protein G已經除去了與白蛋白及細胞表面結合位點，減少了交叉反應和非特異性結合。因此，它比天然Protein G和Protein A有更大的優勢。

Protein G作為親和配基被偶聯到瓊脂糖凝膠或瓊脂糖磁珠上，即Protein G瓊脂糖凝膠和Protein G瓊脂糖磁珠，可以特異性地與樣品中的抗體結合，Protein G可以結合所有人和鼠的IgG抗體亞型包括鼠的IgG₁。Protein G也可以與小鼠的IgG_2a和IgG_2b結合，而Protein A不行。

圖2   Protein G與Protein A的結合位點差異

3. Protein L

Protein L是從馬格努斯消化鏈球菌分離出來的能和免疫球蛋白特異性結合的蛋白，分子量36kDa，與Protein A和ProteinG結合到抗體的Fc區不同的是，Protein L是通過輕鏈相互作用結合的抗體。因為重鏈的任何部分都不會參與結合相互作用，Protein L結合更寬范圍的抗體類，包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD，單個輕鏈（scFv）或者F_ab片段。因此，與Protein A和Protein G相比，Protein L能與更廣泛的含有kappa輕鏈的免疫球蛋白類結合，是親和層析和抗體固定化的有利工具。

圖3   抗體基本結構和Protein A、Protein G、ProteinL結合位點

4. Protein A/G

以基因工程方法重組的Protein A/G包含Protein A的5個免疫球蛋白結合區域和Protein G的2個結合區域，結合能力較單一的Protein A和Protein G有很大提高。更強的Fc段結合能力使之成為免疫球蛋白純化更受青睞的工具。Protein A/G結合人的所有IgG亞型和IgA、IgE、IgM及少量的IgD。

5. 耐堿Protein A

Protein A來源于金黃色葡萄球菌的一個株系，它含有5個可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結合的結構域。耐堿Protein A改造了天然Protein A中的抗體結合域，改造后的配基含有多個與IgG結合的結構域，洗脫條件更為均一和溫和，并具有優異的耐堿性能。

考慮到藥物GMP生產的無菌、無熱源要求，在操作中經常需要使用NaOH清洗，以便去除殘留在層析介質上的雜質和熱源，因此，優異的耐堿性能對于ProteinA介質也尤其重要。

三、ProteinA、G、L、A/G、耐堿Protein A的應用

3.1 抗體純化

Protein A、G、L、A/G、耐堿Protein A最經典的應用就是將其偶聯在瓊脂糖凝膠或瓊脂糖磁珠上進行抗體的純化，如我司Biolinkedinò的抗體純化系列產品（表3）。

表3   Biolinkedinò的抗體純化系列產品

3.2 免疫沉淀or 免疫共沉淀

Protein A、G、L、A/G、耐堿Protein A另外一個重要的應用是免疫（共）沉淀（IP&Co-IP）。免疫沉淀（IP）是利用固定在磁珠或瓊脂糖樹脂等固相支持物上的特異性抗體對抗原進行小型親和純化的方法。需要從細胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術的蛋白和其他生物分子時，免疫沉淀是最常用的方法之一。我司Biolinkedinò的特色產品就是免疫（共）沉淀系列，如下表4所示。

表4   Biolinkedinò的免疫沉淀系列產品

【1】Hnasko, R.M., McGarvey, J.A. (2015). Affinity Purification ofAntibodies. In: Hnasko, R. (eds) ELISA. Methods in Molecular Biology, vol 1318.Humana Press, New York, NY. .

【2】Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., Ma, H.,O’Kennedy, R. (2017). Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography.In: Walls, D., Loughran, S. (eds) Protein Chromatography. Methods in MolecularBiology, vol 1485. Humana Press, New York, NY. .