一、金屬螯合親和技術

1.1 金屬螯合親和技術概述及其原理^[1]

金屬螯合親和技術屬于親和技術的一個分支。1975年Porath首次發現某些蛋白質與某些金屬離子（如Cu²⁺、Fe²⁺）之間的親和力可以作為現代色譜技術中蛋白質分離與純化的基礎驅動力（主要包括Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、Ni²⁺等過渡金屬離子），并指出固定金屬親和技術是基于蛋白質與金屬離子的特異性結合的相互作用過程來實現蛋白的分離純化。該方法的原理示意圖如圖1所示，其中的配體分子為與蛋白有相互作用的金屬離子。作為金屬螯合親和技術，尤其是配體金屬離子，它受到靜電作用力、配位鍵和強共價鍵的共同作用。金屬離子配基屬于通用型配基，具有價格低廉、螯合方便、容量大、可在高鹽濃度下操作、穩定和容易再生等特點。

圖1   IMAC示意圖

金屬螯合親和技術作為一種蛋白質分離純化的高效方法，它基于各種蛋白質分子的組氨酸、半肌氨酸、色氨酸等殘基與許多過渡金屬離子發生不同程度的配位結合的特性，在瓊脂糖凝膠、瓊脂糖磁珠等固相載體上偶聯適當的螯合金屬離子，制備得到金屬螯合親和樹脂，可以選擇性結合特定的氨基酸殘基的蛋白質。隨著生物技術的蓬勃發展，特別是基因工程技術的出現，人們可以按照自己的意愿來設計、改造生物產品，人為地在待分離純化的蛋白質表面或氨基酸序列末端接上對金屬離子有特異性親和的氨基酸或多肽，來實現蛋白質的分離和純化。目前，金屬螯合親和技術已成為蛋白質，尤其是基因重組蛋白及多肽分離純化的最有效工具之一。

1.2 金屬螯合親和技術固定相組成

金屬螯合親和技術中固定相是由基質、間隔臂、螯合劑（絡合劑）和金屬離子四部分組成。基質為固相載體用以承載金屬螯合配體，必須具備以下條件：

（1）載體表面具有大量的活性反應基團，如羥基、氨基、羧基，方便間隔臂的連接；

（2）載體具有良好的生物相容性，在分離過程中不會引起生物分子的聚沉或失活；

（3）載體具有一定的耐酸堿強度，即在較寬的pH范圍內使用；

（4）載體具備成本低廉易得，易于加工、表面光滑、非特異性吸附小，具有一定的耐壓強度。

作為分離蛋白的載體要求粒徑小（200μm以內，）、孔徑大（30nm以上）、表面積大、分布均勻，常見的有交聯瓊脂糖（sepharose）、交聯葡聚糖（sephadex）、大孔硅膠及一些有機聚合物等。

螯合劑是指將金屬離子固定在基質上的物質，既含有與基質共價結合的活性基團如亞氨基、羥基等，又能與金屬離子進行配位螯合。為保證固定金屬離子可以接受蛋白給予的電子對，螯合劑上配位原子數應小于金屬離子的配位數。常用的螯合劑有亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）、次氨基三乙酸（nitrilotriacetic acid，NTA）、N,N,N-三（羧甲基）乙烯二胺（TED）、四乙烯戊胺（TEPA）、羧甲基α,β-二胺丁二酸（CM-DASA）和乙二胺N,N-二乙酸（EDDA）等^[2]。該類試劑的共同點是：（1）分子結構中都含有可提供孤對電子的N、O原子，每個分子的配位原子數至少是3；（2）與金屬離子作用時，生成帶有多個配位基的金屬螯合物，這類螯合物在水介質中與水分子高度溶劑化，具有活潑的羥基和由鹽產生的活性基團。其中，IDA適中的親水性為蛋白質的分離提供了溫和的環境，使其在蛋白質分離有著最廣泛的應用。但IDA是三配位的，所以與金屬離子之間的作用力較弱，容易引起金屬離子的遺漏，TED是五配位的，與金屬離子作用力較強，但由于僅剩一個鍵與蛋白質作用，作用力也較弱。NTA與蛋白質的作用介于兩者之間。

圖2   Ni-IDA、Ni-NTA、Ni-TED與His的相互作用

為了將金屬螯合配體固定在介質上，偶聯前必須使用活化劑將介質活化，形成一段間隔臂，使其末端具有與螯合劑共價結合的活性基團如環氧基團。不同介質的活化劑不同，同一種介質也有很多種活化劑可以使用，需要根據后續需求進行制備。硅膠類介質常用的活化劑主要是硅烷偶聯劑，有縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GOPTS）、氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）等，如圖3、4所示。

圖3   APTES活化反應示意圖

圖4   GOPTS活化反應示意圖

多元醇聚合物介質，目前常用的活化劑有以下若干種：（1）環氧氯丙烷法，環氧氯丙烷活化較為廣泛。環氧氯丙烷法試劑易得，偶聯配基牢固且成本較低，缺點是存在著水解反應和交聯反應等副反應。（2）二氯亞砜法，該法反應溫度較高，反應時間較短，約65℃，5h；缺點是要求體系無水，實際操作不易。（3）雙環氧法，采用雙環氧化合物，一個與介質羥基連接，一個與螯合劑偶聯，典型的反應試劑是1，4-二羥基正丁烷雙縮水甘油醚。（4）溴化氰法，此法最早用于親和樹脂的制備，不過劇毒，目前已很少使用。（5）其他方法，如碳二亞胺法、混合酸配法，各種活化方法各有利弊，根據不同的偶聯對象和實驗目的進行選擇。

圖5   環氧活化基質與IDA、GST偶聯

制備金屬螯合柱時，通常先用化學方法使活化基質與螯合劑偶聯得到具有陽離子交換特性的裸柱，然后灌注選用的金屬離子，待吸附飽和，用平衡緩沖液除去過剩的金屬離子及制備得到所需柱子。如需更換新的金屬離子，可用乙二胺四乙酸（EDTA）去除舊的金屬離子，重新結合新的金屬離子。可以看出，金屬螯合層析技術實質上是把蛋白質與金屬離子在液相中的均相反應轉移到固液兩相進行，經過此步驟，反應的熱力學和動力學性質將發生改變，減小了蛋白與金屬離子在液相作用的自由度，避免了蛋白變性，使分散在溶液中的蛋白質得到富集和分離。

選擇適當的金屬離子可以使親和配基具有良好的重復實用性，又可使親和配基具有較高的吸附量。在選擇金屬離子時，需要考慮兩點：螯合劑的配位數和金屬離子的配位數。螯合劑分子應至少具備兩個配位原子，配位數越多，形成的螯合物也越穩定。金屬離子的配位數直接影響其與螯合劑及生物分子的結合，配位點既要保證能與螯合劑形成穩定的化合物，又要保證有剩余的位點與目標蛋白結合。當對金屬螯合物親和配基穩定性要求較高時，可選擇與金屬離子以4∽5個位點配位絡合的螯合劑；當對配基的親和吸附力要求較高時，則可選擇配位原子數較少的螯合劑，以便為金屬離子留出更多的配位結合位點。常用的金屬離子有：Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co²⁺等過渡金屬離子，常用的螯合劑有亞氨基二乙酸（IDA）、三羧甲基乙二胺（TED）及次氨基三乙酸（NTA）等，金屬離子與螯合劑作用時，一般形成五元環或六元環，結構更穩定，且環數目越多結構越穩定。

二、IDA &NTA，Ni²⁺ & Co²⁺

2.1 IDA & NTA

圖6   IMAC螯合配體IDA和NTA（IDA是三價而NTA是四價；價態用橙色標出）

Porath和同事發明了第一個IMAC瓊脂糖樹脂，他們將金屬離子通過亞氨基二乙酸（IDA）固定到瓊脂糖上。現在商品化IMAC瓊脂糖仍廣泛使用IDA配體，次氮基三乙酸（NTA）在1987年被Hochuli和同事首次引入商品化IMAC中^[3]。在那之后，盡管有其他專用螯合配體（例如TED，TALON^?）陸續問世，但IDA和NTA始終代表最常用的親和純化蛋白IMAC瓊脂糖。從結構上看，IDA與NTA的區別在于NTA多了一個羧甲基基團。從化學性質上看，額外的功能基團使得NTA與金屬離子的配位能力更強，因為NTA擁有四個效價，而IDA只有三個，如表1所示。

表1   IDA與NTA的比較

當兩種配體都有兩個價位可以與組氨酸殘基的咪唑基相互作用時，配位數對純化到的蛋白質量有影響。首先，作為一個三價配體（配位數為3），IDA的金屬離子漏出率極高，尤其是在平衡和洗脫步驟。盡管NTA瓊脂糖的洗脫成分中也含有部分漏出的金屬離子，但明顯少于IDA樹脂。第二，由于目標蛋白性質的變化，用IDA瓊脂糖純化的帶組氨酸標簽的蛋白通常比用NTA瓊脂糖純化的純度低。

然而，IDA也有其自身優勢，配有IDA配體的瓊脂糖通常價格稍低一些。另外，三價配體在洗脫蛋白時需要的咪唑溶液濃度比四價的NTA低。最后，IDA分子更小，可以更高的密度結合到基質上，因此能結合更多的金屬離子。通常來說，低裝載密度可提高目的蛋白純化質量降低目的蛋白純化產量；而高裝載密度可提高目的蛋白產量，但會增加非特異性結合。綜合考量IDA或NTA的裝載密度與不同金屬離子的親和性和特異性（圖7），可以提高特定蛋白的純化產量及質量。

圖7   IMAC常用金屬離子的相對親和性和特異性。一方面，銅親和力高從而純化蛋白產量高，但是特異性較低。另一方面，鈷親和力較低但特異性高，從而能減少洗脫液中非目的蛋白。

2.2Ni²⁺ & Co²⁺

金屬螯合親和技術是基于蛋白質與固定金屬離子的特異性作用進行分離的，根據蛋白質在金屬螯合樹脂的柱保留特征可以把金屬螯合樹脂分為兩類：一類是與蛋白質強烈結合的樹脂，如IDA-Cu樹脂；另一類是與蛋白質結合較弱的樹脂，如IDA-Ni、IDA-Zn、IDA-Co。我們主要討論Ni²⁺和Co²⁺，根據金屬離子所帶電荷、離子半徑以及電子層結構的不同對蛋白質呈現不同的親和力。如下：

Co²⁺螯合磁珠蛋白結合量比Ni²⁺螯合磁珠稍低，但純度更高；

Co²⁺螯合磁珠洗滌和洗脫所用咪唑濃度都比Ni²⁺螯合磁珠低。

2.3正確選擇

如果你追求高產量，而對蛋白純度的要求并不高，那么可以選用IDA。它價格較低，性能穩定，易于再生以及再裝載金屬離子。為減少非特異性結合，可以嘗試使用其他金屬離子如鋅和鈷。如果對蛋白純度要求高的話（例如，為后續結晶做準備），NTA是最佳選擇。通過裝載特異性高的金屬離子（如鈷）可進一步提高瓊脂糖的特異性。NTA的另一個優點是對如DTT和EDTA之類試劑時有較高的耐受性，因此適用于多種樣品緩沖液。瓊脂糖種類的選擇也很重要，基質和純化流程會影響最終的結果。另外，純化蛋白時使用過量的瓊脂糖會導致純度降低，因為很多結合位點沒有和目的蛋白結合而暴露。

當純化少量蛋白時，我們推薦您使用磁珠作為基質；磁珠更適合用于純化稀釋樣品中的蛋白、低表達量的蛋白及pull-down實驗。如果從中等規模培養物中提取蛋白（>50 μg）最好選用瓊脂糖凝膠批量純化或用重力柱純化，瓊脂糖凝膠也可放大用于大量的蛋白的純化。

基于此，我司開發了瓊脂糖磁珠系列，既利用了磁珠的磁性，便于操作和高通量純化，又保留了凝膠介質的特性，適合大規模蛋白純化，一舉兩得。

2.4樣品干擾

被研究樣品中的某些化合物的存在會影響IDA-瓊脂糖和NTA-瓊脂糖的結合能力。DTT（二硫蘇糖醇）是一種還原劑，可保護蛋白質的游離巰基不被氧化，破壞SDS-PAGE的樣品中的二硫鍵。DTT可還原IMAC瓊脂糖的金屬離子，通常會使瓊脂糖的顏色變為棕色。

EDTA對于結合能力的影響更為顯著。許多緩沖液中有這種六價螯合劑來減少金屬離子的干擾。我們的實驗顯示較高濃度EDTA中Ni-NTA比Ni-IDA更有活力。Ni-NTA的結合能力呈非線性降低，EDTA濃度達到1mM時總體下降了46%，之后略微下調。在EDTA濃度達到1mM前, Ni-IDA的結合能力下降幅度與Ni-NTA相似。然后結合能力劇烈下降。

2.5總結

（1）IDA-瓊脂糖介質價格較低；

（2）NTA-瓊脂糖介質洗脫下來的蛋白通常純度較高；

（3）NTA-瓊脂糖介質的金屬離子漏出率明顯較低；

（4）改變金屬離子可以改變瓊脂糖的結合特異性。Co²⁺離子特異性最強，其次是Ni²⁺，Zn²⁺，最后是Cu²⁺。

（5）NTA-瓊脂糖介質抵抗還原劑和螯合劑的能力強。

三、Biolinkedinò相關產品

針對于目前常用的His標簽蛋白純化，我司開發了一系列相應產品，如下表2所示。

表2   Biolinkedinò相關產品

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參考文獻：

[1]孫永亮. 金屬螯合親和色譜填料的制備及其在六聚組氨酸融合蛋白分離中的應用[D]. 陜西:陜西師范大學,2007.

[2]文禹擷.金屬螯合親和配基制備及其在分離豆殼過氧化物酶中的應用[D].2003.

[3]Block H ,   Maertens B ,   Spriestersbach A , et al. Chapter 27Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC)[J]. Methods in Enzymology,2009, 463:439-473.