一、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）概述

1.1 谷胱甘肽S-轉移酶（GST）結構^[1]

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）是由多基因編碼、具有多種功能的超家族酶，GST廣泛存在于細菌、真菌、動物和植物體內的一種解毒系統中，其專一性催化還原型的谷胱甘肽巰基與其他化合物的親電基團，生成谷胱甘肽衍生物，具有降低化學反應活性的效應。在各種生物體內，GSTs是由多個基因編碼的、具有多種功能的一組同工酶，分子量為23∽29kDa，由200∽240個氨基酸組成。有膜結合和胞液兩種形式，以胞液GSTs為主。根據蛋白酶的一級序列、免疫原性、酶動力學和三、四級結構的性質，GST又可以分為多個亞類。

圖1   谷胱甘肽S-轉移酶（GST）的三維結構

迄今為止，在人GST家族中共發現5類胞漿型同工酶，并分別進行了基因定位。其中，同工酶α、π、μ及θ在人體內含量較豐富。人群中并非每個個體都含有這5種同工酶。不同的GST表型是由其編碼基因的多態性決定的。該同工酶編碼基因的純合子缺失導致個體對某種同工酶的缺乏。目前，國內外研究主要集中于GSTμ、GSTθ、GSTπ這3類同工酶及其編碼基因的多態性以及腫瘤易感性關系等領域。

GST同工酶的結構差異較大，氨基酸序列大約只有30%的相似性。其中，GSTα、μ、π的晶體結構具有相似的拓撲方式，每個酶分子都是由相同的兩個亞單位二聚體折疊成兩個結構域。大體上，其N端結構域與還原型谷胱甘肽（GSH）的活性位點結合，是由多肽鏈的氨基端區域的保守氨基酸殘基基團組成，由80個氨基酸排列形成β-折疊和三股α螺旋構成，而且存在一個相當保守的酪氨酸殘基（Try），該Try-5的-OH與GSH硫醇化陰離子形成氫鍵來穩定，從而在催化反應中起到重要作用。N-端結構域是GSH特異性結合位點（G位點）。C-末端氨基酸結構域由其余氨基酸以5∽6股α螺旋構成。C-末端氨基酸結構域是結合疏水底物的位點（H位點），該位點的結構可變性較大，可與各種不同的外源性物質結合。與上述3類同工酶不同的是GSTθ，它的Try-5的-OH不參與形成與GSTα、π、μ活性中心相似的氫鍵，而其Ser-9卻參與了活性中心的形成。而其該Ser殘基在所有GSTθ類同工酶中是相當保守的。

研究表明，盡管不同類型的GST氨基酸序列差異很大，但GST的二級結構及高級結構是非常相似的。每個可溶性GST是由約26kDa亞基組成的二聚體，形成疏水的50kDa的蛋白，等電點在pH4∽5的范圍內。G位點與H位點是由5-10個氨基酸殘基組成的可變連接區連接。不同種類的GSTs氨基酸殘端G位點的功能是不同的，各種GSTs形成的H位點也是不同。H位點的結構影響GST底物的特性，由于H位點的這種特殊性使GST超家族具有催化許多不同結構化合物反應的能力。不同種屬的同型GSTs的同一結構域也有差異。

1.2 谷胱甘肽S-轉移酶（GST）的應用^[2]

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）是具有多基因、多功能的II相代謝酶家族成員，廣泛存在于動物、植物、昆蟲、真菌、酵母和各種細菌中。能夠催化還原型谷胱甘肽與各種親電化合物進行親核加成反應，從而使其極性提高，易于從尿液中排出。因此，GST家族蛋白是一類在外源化合物生物轉化、保護機體免受過氧化作用損害和藥物代謝過程中的一類極為重要的多功能蛋白質。

在生物研究領域，來源于日本血吸蟲的谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）標簽，是目前應用最為廣泛的融合標簽之一。融合標簽技術是利用DNA重組技術將某種標簽編碼基因融合于目的基因的3′端或5′端，再通過適宜的宿主來表達融合蛋白。表達的融合蛋白可以通過其融合標簽與包被在固相基質上的特異性配基結合，從而純化出融合蛋白。1988年，Smith和Johnson首次提出GST融合蛋白的親和純化法，此后廣泛使用。目前，國內外純化GST融合蛋白的主要方法是親和純化法。GST標簽蛋白親和純化，其配基通常是GST的底物谷胱甘肽（GSH），通過酶與底物的特異性結合來實現GST蛋白的分離純化。其原理是：在固相基質上通過巰基結合一個谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉移酶之間的特異性作用力，使得帶GST標簽的融合蛋白與基質上的谷胱甘肽結合，達到分離純化的目的。

圖2   固相基質與配基GSH偶聯實現GST標簽蛋白親和純化

自GST融合蛋白親和純化法問世以來，GST-pull down技術也隨即成為一種研究蛋白質與蛋白質之間相互作用的熱門手段。該技術的原理是：利用重組技術將誘餌蛋白與GST標簽融合表達，融合表達的蛋白經純化后與待測蛋白共同孵育，并用GST瓊脂糖凝膠或GST瓊脂糖磁珠將其分離下來，再通過SDS-PAGE鑒定待測蛋白與誘餌蛋白的相互作用。這種方法簡單易行，操作簡單。此外，GST標簽還有助于對目標蛋白的檢測。

圖3   GST-pull down技術

二、GST標簽蛋白的純化^[3]

谷胱甘肽親和是一種高效的方法，可以一步純化GST標簽蛋白。無論是大腸桿菌或者其他宿主細胞中，天然表達的還是重組表達的，各種來源的GST標簽蛋白，都可以用固定的谷胱甘肽親和層析方法純化，然后用過量的還原性谷胱甘肽競爭洗脫。

GST可以在大腸桿菌細胞質中以可溶性蛋白的形式大量表達，并具有充分的酶活性。此外，許多在大腸桿菌中表達不溶性的真核蛋白被證明在表達為GST融合蛋白時至少部分溶性。當與另一蛋白質的N端融合時，酶的活性通常保持不變。為了生成表達GST融合蛋白的結構，目的蛋白的編碼序列可以使用標準克隆技術插入到商業上可用的載體，如pGEX（GE Healthcare）或pET（Novagen）系列質粒。

固定上谷胱甘肽的GST親和樹脂可用于各種商業來源的GST融合蛋白的純化，通過它們與親和配體谷胱甘肽的強特異性結合。整個流程如圖4所示。

圖4   GST標簽蛋白親和純化示意圖

2.1 GST標簽作用機理

（1）應用于原核表達，作為一種高度可溶的蛋白，能增加外源蛋白的可溶性，在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用；

（2）GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性；

（3）GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑（如：鹽酸胍或尿素等）；

（4）GST融合蛋白已經成為分子生物學領域的基本工具，其廣泛用于研究蛋白質-DNA及蛋白質-蛋白質間的相互作用，也可作為抗原用于免疫學或疫苗的研究。

（5）GST標簽的切除：①凝血酶：一種應用很廣泛的蛋白酶，主要特點是經凝血酶切割后的重組蛋白在切割位點的C端會保留兩個氨基酸殘基。凝血酶可以識別兩種類型的氨基酸序列，分別為X4-X3-P-P[K]-X1?-X2?和X2-R[K]-X1?，凝血酶對前一種序列的識別效果更為理想。②Xa因子：Xa因子是一種較高效的去除融合標簽的工具酶，可特異性識別I-E[D]-G-R-X1序列，并將融合標簽從其C末端切除。

2.2 GST標簽純化蛋白的優劣勢

GST標簽純化蛋白的優劣勢如表1所示。

表1   GST標簽純化蛋白的優劣勢

2.3 GST標簽純化蛋白的常見問題及解決

GST標簽純化蛋白的常見問題及解決方案如表2所示。

表2   GST標簽純化蛋白的常見問題及解決方案

三、Biolinkedinò相關產品

針對于目前常用的GST標簽蛋白純化，我司開發了一系列相應產品，如下表3所示。

表3   Biolinkedinò相關產品

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參考文獻：

[1]王政. 抗GST標簽蛋白單克隆抗體的制備及其活性鑒定[D]. 湖北:華中農業大學,2008.

[2]沈方圓. 標簽蛋白GST納米抗體的制備以及rs11614913、rs2910164多態性與ESCC易感性的關聯研究[D]. 江蘇:蘇州大學,2016.

[3]Schfer F ,   Seip N ,   Maertens B , et al. Purification ofGST-Tagged Proteins[J]. Methods in enzymology, 2015, 559:127-139.