A. 什么是包涵體？

   包涵體是一種不溶的蛋白質形態，往往蛋白在大腸桿菌或其他表達宿主內高水平表達時，由于表達速率過快，部分蛋白部分折疊或錯誤折疊，會有暴露在外的疏水區與其他結構類似的蛋白形成的聚集物。

B．如何盡量避免形成包涵體？

   1.延緩蛋白表達，可以降低誘導溫度或降低IPTG（0.01-0.1mM）并延長誘導時間，或者構建質粒時采用較弱的啟動子。

   2.更換標簽質粒，比如使用含有GST，TrX,MBP等標簽增強蛋白的可溶性。

   3．與分子伴侶共表達

C．包涵體如何溶解和復性？

包涵體溶解常用尿素，鹽酸胍等變性劑，同時也加入一些SDS，巰基乙醇，DTT等還原劑。

復性一般采用稀釋、透析和柱上復性三種方式。

D．包涵體復性如何進行方案設計？

   1.我們要了解蛋白的氨基酸序列，通過分析了解半胱氨酸/胱氨酸含量，二硫鍵，脯氨酸的占比情況。

   2.確定變性劑和添加劑種類和比例

   3.確定復性的方式

   4.明確處理量，方便復性一致性。

E.做抗體可以用包涵體嗎？

   可以，而且不需要復性，可以直接作為抗原。

F．變性的蛋白可以免疫動物制備單抗或多抗嗎？

   可以，其實變性蛋白也屬于天然蛋白，還是具有很強的抗原性，一般這種得到的抗體檢測變性蛋白是沒有問題的，但如果檢測天然蛋白，可能類似做免疫沉淀可能會出現假陽性。

G.包涵體復性后蛋白還有活性嗎？復性效率如何？

   這個需要根據自身蛋白特性和復性的條件決定的。

H.包涵體復性有哪些關鍵點？

   包涵體復性遵循低濃度，低溫，平衡梯度。我們再復性過程中需要注意以下幾點：

1.   復性蛋白濃度控制在0.1-1.0mg/mL,不宜過高，高濃度會容易形成聚集體沉淀，有的蛋白低濃度不穩定，容易變性。

2.   保持4度低溫狀態。

3.   保持最適pH值 8.0-9.0之間。可防止自由硫醇的質子化作用影響正確配對的二硫鍵。

4.   復性時間控制在24-36h.

Biolinkedin純化系列產品推薦

        Biolinkedin今天就分享到這里啦，有興趣的小伙伴可以關注我們公眾號，和我們隨時交流。