一、親和標簽和標簽抗體

20世紀70年代親和標簽技術極大地促進了外源融合蛋白和蛋白質復合體的生產純化，蛋白或者短肽親和標簽現已作為蛋白研究領域必不可少的工具。親和標簽指的是對特定生物或化學配基具有高特異性的蛋白或短肽，兼具高親和性、純化條件溫和、純化步驟簡易和適用性廣的優勢。作為一個無可挑剔的親和標簽需要滿足以下幾點特質：（1）通用性。在任何表達宿主或系統中表達的融合蛋白均能實現分離和純化。（2）能夠融合在目標分子的任意位置，并且對其正確的折疊不產生影響。（3）可以提高目標蛋白的溶解性，提高蛋白表達量。（4）可以位于目標蛋白的表面，便于檢測。

圖1   親和標簽系統

目前已開發出的親和標簽按照分子量的差異，將其分成兩類：一種是結合小分子配體的蛋白標簽，如MBP標簽，GST標簽、GFP標簽等，這些標簽的使用可以增加目標蛋白的溶解性，缺點是對于一些應用如結晶或生產抗體等，標簽必須加以去除；另一種是識別固定化配體的短肽標簽，如HA標簽、Myc標簽、Flag標簽、His標簽、Strep-tag II等，這一類標簽一般不會干擾目標蛋白的生物活性，對于某些應用，小標簽無需去除。短肽標簽對于融合蛋白的三級結構和生物活性的影響取決于標簽的位置和氨基酸組成。表1中列舉了用于分離純化的常見親和標簽。

表1   用于分離純化的常用親和標簽

標簽抗體是指能夠與重組蛋白上的標簽（HA、Myc、Flag、His、GST、GFP等）特異性結合的抗體，可通過標簽融合蛋白免疫宿主的方式得到。它們可以通過抗原-抗體相互作用的原理，特異性結合對應的標簽融合蛋白，應用于檢測和純化各種商品化的表達載體的標簽序列，來分析蛋白的表達含量及其功能，主要應用包括免疫（共）沉淀、免疫印跡、流式細胞、免疫熒光檢測等。標簽抗體已經成為開展基因蛋白表達、信號傳導和基因功能化研究的工具，在細胞超微結構、蛋白質相互作用、蛋白定位研究中發揮重要作用。

二、常見的標簽類別^[1-3]

HA標簽

HA標簽是一種基于人流感病毒血凝素（Human influenza hemagglutinin）抗原的蛋白標簽，其化學本質為一段來自人流感病毒血凝素98∽106號氨基酸的短氨基酸序列（YPYDVPDYA）。HA標簽被廣泛用作表達載體中的表位標簽，其有利于蛋白質的檢測、分離和純化。許多重組蛋白可以表達HA標簽，因為它不會干擾蛋白的生物活性或生物分布。因為市售有多種常用的針對HA標簽的單克隆和多克隆抗體，在靶蛋白上添加HA標簽有助于快速獲得其定位、表達或生物學功能相關信息^[4]。HA抗體也可以固定在固相載體如瓊脂糖凝膠或瓊脂糖磁珠用于蛋白純化。但是，不建議將HA標簽用于來源于凋亡細胞的蛋白，因為HA標簽會被Caspases3和7切割，從而導致免疫反應性喪失。

Myc標簽

Myc標簽是一個具有11個氨基酸的短肽（序列為：EQKLISEEDL），1985年開發出鼠抗c-Myc抗體9E10并被作為免疫化學試劑用于細胞生物學和蛋白質工程領域中^[5]。抗體的11個氨基酸抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別9E10免疫球蛋白。Myc標簽可放在C端或N端，已成功應用在Western blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞術，因此可用于監測重組蛋白在細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳細胞中的表達情況。Myc標簽的蛋白可通過將9E10單克隆抗體偶聯到固相介質上如瓊脂糖凝膠或瓊脂糖磁珠來進行親和純化，洗脫是采用低pH洗脫，但低pH往往會降低蛋白質的活力，所以Myc標簽系統更廣泛地應用于檢測而較少用于純化蛋白。

Flag標簽

Flag標簽是M1單克隆抗體識別的親水八肽（DYKDDDDK），分子量小^[6,7]。Flag標簽作為一種短肽標簽，不會對重組蛋白中的表位與結構域造成遮蓋，不會影響重組蛋白的功能。同時，Flag標簽具有高親水性，可定位于重組蛋白的表面，便于重組蛋白的檢測。Flag標簽純化系統利用合成的Flag短肽競爭性洗脫重組蛋白，不會對重組蛋白的生物活性造成影響。缺點是Flag短肽的合成成本較高，僅適用于小規模的純化工作，不適合工業化放大，同時還需要添加額外的操作步驟除去結合在層析介質上的Flag短肽。值得注意的是，Flag標簽含有腸激酶結合位點（DDDDK），使用腸激酶把標簽切除。將3個Flag標簽串聯起來的3xFlag標簽，在兼具Flag標簽優點的同時，具有更高的檢測靈敏度，與其他檢測體系高20-200倍^[8]，尤其適合哺乳動物細胞表達系統中目標蛋白表達水平比較低的情況。親和純化過程中，融合一個3xFlag標簽可以得到一個更為顯著的純化效果，同時能更好地保持小分子蛋白的生物活性。

圖2   Flag標簽系統

His標簽

His標簽通常是由5∽15個組氨酸組成，是目前蛋白高通量純化中使用最廣泛的親和純化標簽，在多種表達系統融合蛋白的表達純化工作中都適用^[9-11]。由于結合量高、成本低廉、高通用性、純化條件溫和、結合特異性高、多種上樣條件可供選擇，在變性和非變性條件下均不影響重組蛋白的親和純化等特點^[12]，His標簽公認為是重組蛋白分離純化的第一選擇。一般采用金屬螯合層析技術實現融合His標簽融合蛋白的分離純化，金屬螯合層析是自1970年發展起來的一種高效的分離純化手段。蛋白質表面的半胱氨酸、組氨酸、色氨酸等能與金屬離子發生配位鍵結合。值得注意的是，并非所有的目標蛋白都適合與His標簽融合，采用金屬螯合層析的方法實現分離純化。宿主蛋白中若存在半胱氨酸和組氨酸豐富的結構域，在金屬螯合層析過程中會發生雜質蛋白的非特異性識別^[13]；目標蛋白中如果含有金屬離子，通常也不推薦使用金屬螯合親和層析。His標簽可以與二價金屬離子發生配位鍵結合，如Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺等。我司已開發出多種基于不同基質的親和層析樹脂包括His標簽蛋白純化瓊脂糖凝膠和His標簽蛋白純化瓊脂糖磁珠，間隔臂有IDA和NTA兩種（圖3），目前在售的是IDA的間隔臂，后續會推出以NTA為間隔臂的His標簽蛋白純化介質。

圖3   亞氨基二乙酸（IDA）和次氮基三乙酸（NTA）的結構

Strep-tagII標簽

Strep-tag II標簽是與鏈霉親和素發生特異性識別的肽段，由8個氨基酸（WSHPQFEK）構成。生物素和鏈霉親和素之間有著非常劇烈的非共價作用，二者的解離常數數量級在10^-14mol/L左右^[14]。Strep-tag II能夠融合在目標蛋白的任何位置，不會對目標蛋白的正確折疊造成干擾。同時Strep-tag II在純化過程中不需要金屬離子，不與重金屬緩沖液的離子反應，不會發生蛋白質聚集現象，因此適合用在含金屬離子的重組蛋白的分離純化上。以上優點使得Strep-tag II適用于哺乳動物細胞和原核細胞表達系統中多種融合蛋白的表達純化。在進行重組蛋白序列構建時，可在蛋白質和Strep-tag II之間添加2個氨基酸，確保Strep-tag II充分暴露。將鏈霉親和素的氨基酸進行定點突變，得到了與Strep-tagII有著更高親和力的親和層析介質Strep-Tactin，在Strep-tagII融合蛋白的親和純化中具有更優異的表現，主要體現在高蛋白產量和合適的成本。Strep-tag II親和純化系統使用2.5mmol/L的脫硫生物素作為洗脫緩沖液，HABA（4-Hydroxy-azobenzene-2-carboxylic acid）溶液作為Strep-Tactin層析介質的再生緩沖液。也有研究發現，將兩個Strep-tag II標簽通過一個12個氨基酸組成的鉸鏈串聯，便得到一個新標簽Strep-tag III，其在哺乳動物細胞表達系統中蛋白復合體的純化與檢測更具優勢，大幅提高其檢測靈敏度^[15]。我司后續會推出Strep-tag II標簽蛋白純化介質來滿足更多客戶的需求。

圖4   Strep-tag II標簽

GST標簽

GST（谷胱甘肽S-轉移酶）標簽由21個氨基酸組成，分子量大小為26kDa，能特異性的與其底物谷胱甘肽結合，廣泛應用于融合蛋白表達與分離純化中^[16]。融合有GST標簽的目標蛋白可以與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合，再用酶將GST標簽切除，即可得到單純的目標蛋白。大量實驗數據表明，當外源基因在大腸桿菌中過表達，包涵體的出現幾率大大增加，不溶性的聚合體的出現降低了可溶性重組蛋白的產量，加大了后續分離純化的難度，提高了分離純化的成本。GST能夠快速折疊并具有良好的水溶性，因此GST標簽可以在很大程度上增大重組蛋白的溶解性，使重組蛋白可溶表達。GST標簽兼具可實現分離純化、提高目標蛋白的水溶性和蛋白含量、純化條件溫和、親和樹脂價格低廉的優勢。除了應用于重組蛋白分離純化外，GST還可以催化外源性物質結合到谷胱甘肽，可以對諸多環境毒素包括化療藥物、殘留的農藥、除草劑及致癌物質起到分解解毒作用。

圖5   谷胱甘肽（GSH）的結構

MBP標簽

MBP（麥芽糖結合蛋白，maltose binding protein）標簽由396個氨基酸組成，分子量大小為40kDa，由大腸桿K12菌中MBP基因編碼。1988年，MBP親和標簽首次應用于大腸桿菌重組蛋白的表達純化，MBP標簽與直鏈淀粉樹脂特異性結合，通過競爭性洗脫的方式將重組蛋白洗脫，同時利用位點特異性蛋白酶將MBP標簽切除。兩個分子伴侶系統Dnak-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES聚集到目標蛋白的附近協助MBP的正確折疊。MBP標簽可以減少重組蛋白的降解性，提高可溶性和表達量，作為促使外源蛋白可溶性表達的輔助蛋白而得到廣泛的應用^[17]。然而，從重組蛋白純化的角度來說，MBP標簽并不是一個完美的純化標簽。一方面由于MBP標簽不能全部特異性被親和樹脂吸附，另一方面親和層析后得到的重組蛋白的純度不能完全滿足要求。為了提高MBP標簽與直鏈淀粉樹脂的麥芽糖的結合，通過對MBP標簽進行氨基酸突變改造實驗，發現在MBP標簽與目標蛋白序列添加一個由10個天冬酰胺構成的鉸鏈，能夠提高某些重組蛋白與直鏈淀粉樹脂的特異性識別。

GFP標簽

最早出現的綠色熒光蛋白是下村修等人于1962年從維多利亞水母中分離出一種在長紫外光照射時可以發出綠色熒光的蛋白，稱為GFP，該蛋白是由238個氨基酸組成的多肽鏈構成，亞基分子量約為27kDa，野生型綠色熒光蛋白在395nm處有最大光吸收，能夠吸收藍光，當受到紫外線或者鈣離子激活時，能夠發出綠色熒光，最大發射峰為509nm。GFP熒光蛋白的生色團的形成是沒有物種特異性的，是不需要任何外源反應底物的。熒光的產生只需要在含有氧氣的環境下，分子內的第67位的Gly的酰胺對第65位Ser上羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基，第66位Tyr的α-2β鍵脫氫反應之后，導致芳香團與咪唑基結合，GFP分子就形成對羧基苯甲酸唑環酮生色團從而發光^[18,19]。

圖6   綠色熒光蛋白的動物

GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其他酶類報告蛋白無法比擬的。它的優點有：（1）熒光極其穩定；（2）GFP抗光漂白能力比熒光素強，一些弱還原劑并不能夠影響熒光性質；（3）細胞自發熒光，熒光的產生不需要任何外源反應底物，對細胞低毒害，可直接用于活細胞測定。但是野生型GFP熒光強度較低，且在37℃不能正確折疊，在一些植物細胞中并不表達，其應用受到了限制。人們就對GFP做出大量的改進，在溶解性、折疊性、溫度敏感性、熒光強度、熒光光譜、密碼子偏愛性等方面做出了大量的突變體。

GFP或其突變體EGFP等被廣泛用于基因表達效率的檢測，以及和目的蛋白融合表達用于檢測目的蛋白的表達和分布。一般來說，GFP抗體不僅可以檢測GFP或其適當的突變體，也可以檢測和GFP或其適當的突變體融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測GFP融合表達蛋白等。

GFP標簽可位于蛋白質的C端或N端，該系統已廣泛應用于各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等，相應的GFP標簽抗體也被廣泛應用。

三、親和標簽的組合使用

His₆-MBP組合標簽

His₆-MBP組合標簽是目前普遍常用的一種親和標簽組合方式。在此組合中，融合蛋白的形式為“His₆-MBP-目標蛋白”，其中His標簽用于融合蛋白的親和純化，MBP部分能夠增大目標蛋白的可溶性，提高蛋白產量，His₆-MBP與目的蛋白之間加入一段煙草蝕紋病毒蛋白酶切位點，便于后續的標簽去除。

串聯親和純化

該技術方法主要研究蛋白質之間的相互作用。通過在目標蛋白的一端嵌入一個特殊的蛋白標簽（如TAP標簽），不破壞目標蛋白的調控序列，經過連續兩步的親和層析獲得接近自然生理條件下的特定蛋白質復合體，然后用質譜技術鑒定蛋白質。該技術既吸收了親和純化得到高純度低拷貝數的蛋白質復合體，也繼承了免疫共沉淀中運用特異性的標記蛋白與親和層析柱之間的相互作用，可快速得到獲得生理條件下與目的蛋白存在真實作用的蛋白質。

四、Biolinkedinò相關產品

針對于目前常用的標簽及標簽抗體，我司開發了一系列相應產品，有免疫沉淀系列和蛋白純化系列。如下表2所示。

表2   Biolinkedinò相關產品

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