隨著單克隆抗體產品成功走向商業化，各種形式的抗體片段正在成為下一代治療蛋白的重要類別，其中包括Fab類及Fab融合蛋白。VHH sdAb是從駱駝科動物的重鏈抗體可變區（VHH）衍生得到的。這些VHH代表一些最小的抗原結合抗體衍生蛋白。因此它們比full-size的mAbs更穩定，可在微生物體中產生，使每克產品可提供更強的靶向結合活動。因缺少Fc區，這些抗體片段無法被多數重組Protein A親和配基捕獲。但Amsphere?A3 Protein A配基對VHH單域抗體表現出高親和力（圖1）。

圖1：Amsphere A3和其他四種市售Protein A親和填料（按基質類型）用于純化二價VHH（Ablynx?的VHH sdAb X），在保留時間3分鐘條件下的DBC比較。進料：從Pichia Pastoris培養物收獲的HCCF。層析柱：直徑0.5cm；柱床高度5.0cm

與其他四種市售PrA填料相比，Amsphere A3的DBC最高。其中性能最相近的填料的DBC比Amsphere A3低40%，而且由于其采用玻璃基質，堿穩定性較差。圖1所示結果是在默認的Protein A親和純化條件下（包括在pH值為3的條件下進行VHH洗脫）測得的（表1）。

表1：圖1所示DBC值的測定條件

圖2顯示使用Amsphere A3對VHH進行批量純化的層析性能，表明洗脫體積小，而且蛋白回收率和HCP清除率高。

圖2：使用Amsphere A3進行VHH sdAb純化的層析圖

藍色：UV280吸光度

棕色：電導率（mS/cm）

紫色：pH值

在GE Healthcare的?KTA? avant 25系統上進行實驗。使用第二代畢赤酵母HCP ELISA試劑盒（Cygnus Technologies，貨號F640）進行HCP測定

圖1所示結果是基于Amsphere A3配基與VHH sdAb間的相互作用測得的，因此進一步研究兩者的相互作用很有意義。由于與Herceptin?單抗的Fab區結合已得到證實（未顯示數據），我們還研究了與VH結構域結合的機制；評價了VHH與Amsphere A3結合的條件；比較分析了VHH與mAbs的DBC數據；比較了Amsphere A3與其他現有樹脂類型在抗體片段捕獲方面的應用；最后描述了Amsphere A3可用作捕獲填料的抗體片段變體范圍。

我們與布魯塞爾自由大學（VUB）細胞和分子免疫學實驗室合作，分析得出了VHH-PrA復合物的晶體結構。圖3為晶體結構分析過程中各步驟示意圖。

圖3：對VHH sdAb與Amsphere Protein A配基單體形成的復合物進行晶體結構分析的各個步驟概覽

通過上述過程（圖3）分析得出圖4所示的晶體結構。兩種蛋白結構的分辨率均達到<2?ngstroms，并且在復合物中得到充分界定。左側可以看到Protein A單體的3個螺旋。右側可以看到VHH的典型結構，其中具有2個分別包含4條和5條β鏈的片層。包含5條β鏈的片層對應于VH中通常與經典抗體中的VL域發生相互作用的一側。包含4條β鏈的片層片暴露在溶劑中，不參與抗原識別。3個CDR位于VHH分子頂部的環形區。

VHH的結合位點位于Protein A配基的螺旋2和3中。已確定Protein A中有7個氨基酸在與VHH的相互作用中最為重要。Fc區的結合位點位于螺旋1和2中，而螺旋2中的谷氨酰胺是唯一參與Fc與VHH結合的氨基酸（Graille等，2000）。

Protein A的相互作用位點位于VHH的框架區1和3。這是包含4條β鏈的片層側。VHH中有8個氨基酸朝向Protein A結構域，這些氨基酸主要是極性和/或帶電殘基：Ser17、Arg19、Lys65、Thr69、Ser71、Gln82、Asn84和Ser85。

為驗證是否存在類似的Fab結合機制，使用已發布的人Fab片段中VH域晶體結構對本項目中的VHH進行疊加（圖5）。很明顯，這兩個域呈現極好重疊。VHH中與Protein A相互作用的所有氨基酸在VHH和該VH域之間共享。所有這些氨基酸也保留在Herceptin的VH域中（未顯示序列比對）。這有力表明VHH和VH域具有相似的結合機制。在經典抗體的VH域中，Protein A結合區不和VL域相互作用，且不參與抗原結合。

表2顯示了兩種進料的平均運行持續時間和生產率值。這些值包括系統沖洗所需的時間（在步驟之間執行，使用下一步驟的緩沖液沖洗層析系統）。此過程中的每次系統沖洗需要20秒。所得的生產率值是在典型批量捕獲過程中使用層析柱和柱床高度為20cm時所得相應值的10倍。

在不同結合條件下對VHH sdAb進行測定。相關層析條件與表1相同。僅改動進料條件，如表2所示。

注意，這些條件包括進料pH值（6.9 - 7.5）、電導率（8.3 - 43.5 mS/cm）和目標濃度（1.7 - 4.2 g/L），在這些條件下均測得了優異的DBC值。

表2：在一系列進料條件下，Amsphere A3純化VHH sdAb X（源自Ablynx）的DBC結果（*）：HCCF = 源自Ablynx（畢赤酵母上清液）的澄清進料VHH sdAb X。層析柱：直徑為0.5 cm，柱床高度為5.0 cm（Repligen的預裝柱）

由于與Protein A的相互作用基于帶電殘基，預測此相互作用依賴于鹽。因此，再次檢測VHH是否會在高鹽濃度下洗脫（表3和圖6）。

表3：VHH sdAb X與Amsphere A3結合的電導率依賴性研究方案。（*）：HCCF = 源自Ablynx（畢赤酵母上清液）的澄清進料VHH sdAb X（濃度4.08 g/L）- pH值為6.9和電導率為8.8 mS/cm

圖6：Amsphere A3純化VHH sdAb的色譜圖。在使用1M NaCl執行洗滌步驟后，sdAb仍與層析柱結合。藍色：UV280吸光度；棕色：電導率（mS/cm）；紫色：pH值

在使用1M NaCl執行洗滌步驟后，sdAb仍與層析柱結合。對于通過木瓜蛋白酶消化Herceptin而產生的Fab片段，發現呈鹽依賴性結合（未顯示數據）。因此，建議采用低電導率條件（< 5.0 mS/cm）對VH結構域相關靶標進行初始結合研究，但可能會探索更高電導率條件。

單價和二價VHH所示的載量值（g/L）約為full-size mAbs的1/2-1/3（圖7）。然而full-size IgG的MW（約150 kDa）約是單價VHH（約15 kDa）的10倍。圖7中數據表明，mAbs的保留時間為5分鐘，而VHH靶標的保留時間僅為1分鐘。對于較小的VHH靶標，1分鐘和5分鐘時的DBC未見顯著差異。

與圖7等效的摩爾DBC數據（代表與樹脂結合的分子數，表示為μmol/L）如圖8所示。每個多聚Protein A配基結合的單價VHH約是mAbs的3至4倍。這些結果可能反映了每個Protein A配基與多個靶標的結合存在空間位阻限制。

目前有兩大類填料可用于抗體片段捕獲。離子交換和混合模式填料根據靶標分子在既定pH值和鹽濃度下的表面電荷將其與雜質分離。使用這些填料可獲得更高結合載量。然而，與這些填料類型相比，Protein A的優勢在于工藝開發時間明顯縮短。Protein A層析所需的工藝開發工作更短。此外，由于采用的是親和步驟，在捕獲步驟后即已達到極高純度，同時產品回收率超過95%。在有限工藝開發相關中，親和層析有潛力用于平臺捕獲步驟。

第二類填料是專為結合特定抗體域（如Protein G或Protein L）而生產的親和填料（Rodrigo等，2015）。與這些填料相比，Amsphere A3具有良好的堿穩定性，可提高運行次數，從而降低每克純化產品的成本。Amsphere A3還可在較高pH值（例如3 vs 2）下進行靶標洗脫。表4概述了Amsphere A3在不同NaOH濃度下的暴露時間相關的化學穩定性結果。根據所需的CIP和消毒方案，可利用表中的數據計算樹脂壽命（循環次數）。其中給出了80%DBC保留率，因該值通常用作確定填料有效壽命的終點。

表4：Amsphere A3的堿穩定性數據。其中顯示了在不同NaOH濃度下，當多克隆IgG 4min保留時間時DBC仍為初始值的90%和80%時所經過的暴露時間

圖9總結了Amsphere A3相較于其他填料類型在抗體片段初級捕獲方面的上述優勢。

圖9：Amsphere A3相較于其他填料類型在抗體片段初級捕獲方面的優勢示意圖

上述研究為Amsphere A3與VH(H)抗體形式結合的分子基礎提供了一些見解。圖10總結了Amsphere A3的2種可變區結合靶標。

圖10：與Amsphere A3結合的可變區概述

文獻反映Protein A與VH的結合僅限于人VH3亞家族的分子，未包括來自任何其他基因家族的示例。在幾乎所有情況下，結合的減少或消失可能與所述殘基發生突變有關。特別是對于VHH sdAb，與Ablynx NV合作篩選出110種分子，其中99%顯示與Amsphere A3 Protein A配基結合。相互作用的殘基位于框架區（因此不參與抗原結合）并且與Fab中的VL并不相互作用，基于這一事實，有可能會將非Protein A相互作用性Ab片段誘變成結合劑（Fridy等，2015；Henry等，2016）。

圖11顯示了適合將Amsphere A3用作捕獲填料的各種形式的抗體片段。可分為3大類：VHH單域抗體和包含VH3結構域的結構體（如Fab和scFv）。

圖11：不同類型抗體和抗體片段的概述。綠色框指示了適合將Amsphere A3用作捕獲填料的各種形式的抗體片段：包含VH3結構域的分子和VHH單域抗體。（原圖：Holliger & Hudson，2005）

除用于含Fc的抗體和結構體之外，Protein A填料Amsphere A3還可用于純化VHH單域抗體等形式的抗體片段、包含VH3結構域的結構體（如Fab）及不同的融合蛋白（如單鏈可變片段）。這些結合靶標的概述見圖12。基于Protein A的填料具有熟知的耐用性、高選擇性、可擴展性和監管接受性，因此Amsphere A3可成為一種理想的平臺技術，極大限度地縮短DSP開發時間。