超速離心法是公認的外泌體分離金標準方法，也是分離包括細菌、病毒、亞細胞結構（subcellular organelles）等的常用方法。超速離心的方法可分為密度梯度離心(density gradient ultracentrifugation)和普通的差異超速離心（differential ultracentrifugation）兩大類。它的基本原理是根據顆粒大小、重量和密度等的差異，梯度施加離心力（centrifugal force）實現分離，離心力最高可加到（100 000 and 150 000 g）故稱超速離心。總的來說超速離心是廣為使用的經典方法，但也存在可能影響外泌體結構而影響后續分析等不足。

（超速離心分離外泌體示意圖）

第二類分離技術著眼于外泌體顆粒的大小（Size-based technique），以超濾為代表，也經常用于從體液（血清、尿液、腦脊液等）和培養液中收集外泌體。它的最大優勢在于不依賴復雜的設備，且分離過程雖然耗時但操作相對簡單。不過相對而言，獲得的外泌體純度可能相對差一點，且超濾過程的剪切力（shear stress）也對外泌體結構可能有一定影響。

（超濾分離示意圖）

這一類分離技術的理論基礎是外泌體雙層膜結構上表達有特征性蛋白(marker proteins)，于是可以借助特定的抗體來捕獲外泌體。它的優勢包括基于抗原抗體識別的免疫機制，故純度較高；同時根據不同的表面標記，可以區分不同的亞組，有助于進一步的機制研究。缺點在于樣品制備困難、花費高，且產量較低。

（免疫親和純化示意圖）

沉淀的基本原理是使用聚合物分子結合水分子，以此降低外泌體在培養基、尿液等液體中的溶解度，通常使用聚乙二醇(polyethylene glycols, PEGs)。沉淀法的最大便利在于不需要特定設備，就能獲得較多量的外泌體，缺點在于雜質較多。

（沉淀分離示意圖）

基于微流控的分離方法是兼顧外泌體物理屬性和生物化學屬性的新方法，主要步驟包括免疫親和(immunoaffinity)、過篩(sieving)、多孔結構捕獲外泌體(trapping)，僅需少量樣本即可。將微流控技術和前面的分離方法聯用的話，可以提高產量和純度，可惜技術門檻較高，有礙大規模使用。

（微流控分離示意圖）

以上便是常見的幾種獲取外泌體的方法，而初步獲得了外泌體之后，還需要進一步的純化、確認等等過程。

參考：

Li Pin,Kaslan Melisa,Lee Sze Han et al. Progress in Exosome Isolation Techniques.[J] .Theranostics, 2017, 7: 789-804.

Yang Dongbin,Zhang Weihong,Zhang Huanyun et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.[J] .Theranostics, 2020, 10: 3684-3707.