細胞外囊泡在近年較為火熱，它不僅可以作為生物標志物，對于疾病治療也有很大作用。這次就讓我們從這篇最近發表的高分綜述（IF=84.694）中重新回顧一下細胞外囊泡與疾病的關聯及其作為治療的新策略。希望可以對你有所啟發。
細胞外囊泡(EV)研究領域在過去十年中迅速發展，從基礎生物學研究發展為具有重要臨床意義的學科。現在正在認識到利用EV診斷和治療疾病（包括癌癥、神經和心血管疾病）的潛力。因此，正在積極探索EV作為治療靶點、生物標志物、新型藥物遞送劑和獨立療法的應用。本綜述簡要概述了各類EV的特征和生理功能，重點介紹了它們與疾病的關聯以及用于治療開發的新興策略。細胞外囊泡(EV)是細胞釋放到細胞外空間的膜衍生囊泡，在細胞間通訊中發揮重要作用，參與調節一系列生物過程。在過去的十年中，人們對EV的類別和特征及其生理和病理作用的認識迅速增長。剖析EV的生物發生過程揭示了幾個不同的類別，它們是通過內體途徑或非內體途徑產生的。EV由原核細胞和真核細胞分泌，但對真核細胞產生的細胞進行了更深入的研究。迄今為止研究的所有哺乳動物細胞類型——包括神經元細胞、內皮細胞、間充質干細胞(MSCs)和上皮細胞——都被發現可以釋放EV。EV也可以在血液、滑液、尿液和唾液等生物體液中找到。然而，很難對正在研究的EV類型進行有把握的分類，因為它們可以在分泌前用各種生物發生途徑共有的標記進行修飾。然而，EV的特點是大小和同質化程度，這取決于分離方法。所有EV都被脂質雙層包圍，它們的直徑范圍從50?nm到2,000?nm，具體取決于它們的生成方式。國際細胞外囊泡協會(ISEV)已發布指南，以幫助研究人員表征EV并確定其EV制劑的純度。MISEV2018建議EV研究人員考慮使用指示EV物理特性的命名法，例如尺寸（可將小型EV設定為直徑<100?nm或<200?nm的EV，將直徑>200 nm稱為中/大型EV）、密度、某些生化成分的存在（例如CD63+EV）或來源的條件或細胞（例如腦源性EV）。其他研究應確定正在研究的EV的功能，應使用誘導劑和分泌抑制劑等工具來區分可能的EV類別或將它們與非EV產品進行比較。本篇綜述中使用的EV命名法基于MISEV2018的指南。在缺乏EV特征或所研究的EV類型的不確定證據的情況下，使用通用術語EV。EV可以在正常生理條件下以及在病理過程中釋放。雖然早期研究的重點是了解不同類別EV的生物發生，但最近的研究調查了EV在癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病等各種疾病的病理學中的作用。EV的病理能力是從它們的特定內容物中獲得的，這些內容物是從起源細胞中包裝出來的，代表了親本細胞的狀態。例如，EV與阿爾茨海默病(AD)中的淀粉樣蛋白-β(Aβ)等神經毒性蛋白和病毒等感染因子的傳播有關。EV越來越多地被認為是許多疾病的貢獻者，它們既可用于研究病理學，也可用作診斷生物標志物。幾項研究旨在針對EV，例如通過使用可以阻止EV釋放或阻止其被鄰近細胞吸收的抑制劑。EV研究最近的一個重點是利用它們作為治療分子的靶向遞送載體，例如小化合物、蛋白質和小干擾RNA(siRNA)。最廣泛使用的EV應用是由發現MSC衍生的EV對心血管疾病和癌癥的治療有益，并且可能比親本MSC或其分泌組更有效。公司已經生產了旨在封裝治療劑的外泌體，或者已經使用遺傳方法編程以靶向特定組織和細胞類型的外泌體。本綜述概述了EV的生理和病理作用，重點關注癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病。討論了EV在治療上的新興潛力——作為靶點、治療劑、藥物輸送工具和生物標志物——同時考慮了相關的挑戰和限制。EV分為三種生物型，即外泌體、微泡和凋亡小體，由它們的生物發生決定。然而，本綜述使用通用術語EV，除非討論的研究使用概述的方法描述了它們的EV制備。ISEV定義EV的最低實驗要求。小型EV的直徑為50-150nm，可以包含異質的“經典”或“非經典”外泌體群。源自內體途徑的經典外泌體通過晚期內體膜向內內陷形成多泡體（MVB）（圖1）。轉運所需的內體分選復合物(ESCRT)蛋白，包括ESCRT-0（肝細胞受體酪氨酸激酶底物(HRS)；也稱為VPS27）、ESCRT-I（腫瘤易感基因101(TSG101)）、ESCRT-II(VPS25)和ESCRT-III（CHMP4A、CHMP4B和CHMP4C）參與募集內容為并形成晚期內體膜的內陷。ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II負責識別泛素化的內容物并將其加載到內體的管腔中。ESCRT-II蛋白激活ESCRT-III的組裝，其募集輔助蛋白，如ALG-2相互作用蛋白X(ALIX)和VPS4，以協調MVB中腔內囊泡(ILV)的形成。不依賴ESCRT的途徑還可以通過鞘磷脂酶水解和中性鞘磷脂酶2(nSmase2)形成的神經酰胺介導MVB的向內出芽。神經酰胺誘導MVB膜的自發負曲率形成ILV。然后MVB與細胞膜融合并將ILV（現在定義為外泌體或“外泌體樣囊泡”）釋放到細胞外空間。RAS相關蛋白RAB27A（RAB27A）和RAB27B都是質膜外泌體分泌所必需的。在MVB中形成期間，ILV可以包裝內體蛋白、細胞溶質蛋白以及反映其親代細胞的特定蛋白質和基因組內容物。諸如CD63之類的四跨膜蛋白在引導EV內容物方面發揮著作用，因為它們參與了質膜和幾個細胞器之間的回收途徑。小型EV通常在去除凋亡小體和微泡后通過100,000g超速離心分離。它們可以使用速率區域離心進一步純化，以通過Optiprep梯度解決小囊泡。已發現小型EV富含四跨膜蛋白（CD63、CD9和CD81）、膜轉運蛋白（RAB蛋白和膜聯蛋白）和參與MVB形成的蛋白（ALIX、TSG101和網格蛋白）。蛋白質分選機制的成分，例如與ESCRT途徑相關的成分，也可以在EV制劑中檢測到，并可用于提高定義被分離EV亞型的信心。這些蛋白質的存在有助于區分正在研究的EV是否可能是對經典外泌體標記（如CD63、CD9和CD81）呈陽性的小型EV，或者是不表達這些四跨膜蛋白的非經典外泌體。從細胞中脫落的微泡大小范圍從150?nm到大于1,000?nm，平均大小為250-400?nm，可以稱為大EV。微泡通過細胞膜的向外出芽產生，細胞膜分離并成為囊泡（圖1）。細胞溶質生物分子的特異性胞吐作用是隨機的，但膜蛋白和受體在微泡出芽之前靶向質膜。膜的出芽發生在質膜的特定位置，并受磷脂再分布以及Rho激酶介導的肌球蛋白輕鏈磷酸化和收縮機制的影響，以允許囊泡收縮和分離。微泡通常以脂質組成、質膜受體和反映其細胞來源的分子為特征。微泡內容物由向質膜運輸的生物分子組成，通常包含片段化的核糖體RNA(rRNA)和mRNA。通過首先去除凋亡小體，然后以10,000g離心上清液，可以從條件培養基和生物體液中分離微泡。類似大小的微泡和微粒已在細胞生物學中得到廣泛研究，因為它們很容易使用透射電子顯微鏡(TEM)和熒光激活細胞分選(FACS)等常用方法檢測到。凋亡小體代表最大的EV類別，尺寸為1-5?μm。它們是通過細胞死亡過程中凋亡細胞膜的特征性起泡和突出產生的（圖1）。在由正常生理信號傳導或致病過程觸發的程序性細胞死亡后，發生膜起泡，形成凋亡突起，即微管尖峰、凋亡和珠狀凋亡。這些突起分解形成凋亡小體，包圍整個細胞器、核基因組DNA、片段化的核酸和隨機封閉的內容物。通常，通過巨噬細胞識別質膜標記物，然后進行吞噬作用，可以去除凋亡小體。去除細胞碎片后，可以在2,000g–4,500g的相對較低的離心速度下沉淀凋亡小體。它們對幾乎所有細胞標志物都是陽性的，包括那些與微泡和外泌體重疊的標志物，因此大小是區分凋亡小體與其他EV的重要特征。已證明凋亡小體呈遞CX3C-趨化因子配體1(CX3CL1)和細胞間粘附分子3(ICAM3)以吸引吞噬細胞進行吞噬并含有大量的18S和28SrRNA，具有不同程度的降解，與微泡和外泌體相比。在TEM下，可以在大的圓形凋亡小體中觀察到染色質。細胞來源標記、分離方法和囊泡大小可用于使用體外模型從其他EV中識別凋亡小體。微泡和外泌體在生物體液中得到了很好的研究和分離，但與較小的EV相比，血液中循環的凋亡小體的相對數量尚不清楚。近年來，人們假設凋亡細胞與其他細胞交流，特別是通過凋亡小體傳播致瘤性和水平DNA轉移并促進炎癥。小型和大型EV都可以在生理條件下從正常健康細胞中釋放出來，以確保細胞間通訊，從而調節從細胞維持到免疫反應的一系列生物過程。由于EV的功能已在其他地方進行了深入討論，因此下文僅簡要概述了其關鍵功能。應該注意的是，EV在正常生理條件下的確切作用仍然是不完全理解。這是因為缺乏生理體外和體內模型來驗證EV對其他細胞通信模式的貢獻以及EV群體的異質性，而EV的亞群缺乏精確的定義。EV在細胞間通訊中發揮著重要作用——它們在細胞之間轉移腔內EV內容物，包括蛋白質、脂質和調節RNA——以維持正常生理。EV使用多種機制來介導細胞間通訊，例如直接與受體細胞的質膜融合，以實現跨膜蛋白和脂質的交換。EV和質膜之間脂質膜分布的相似性可以提供一種在機制上類似于吞噬作用的攝取途徑。EV攝取機制也已被證明發生在幾乎所有已知的內吞作用途徑和膜融合事件中，由網格蛋白依賴性或網格蛋白非依賴性機制介導，這些機制已在其他地方進行了廣泛綜述。在質膜和MVB內發現的允許分泌和攝取的特定特征已全面詳細說明。由于體內循環的EV群體的異質性，解開由EV細胞間通訊介導的生理功能網絡是一個挑戰。該領域對用于研究EV內容物功能轉移的方法提出了挑戰。雖然關于EV靶向特定細胞和組織的能力仍有很多發現，但該領域已經利用了各種EV吸收機制和內容物-加載方法以利用其用于治療用途的途徑，這將在下面進一步討論。在不同環境中從某些細胞類型中攝取EV可能使特定目標細胞有效地使用傳入的內容物。通過將細胞表面受體（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）包裝到EV表面以捕獲纖連蛋白并促進外泌體-細胞相互作用，可以促進生長因子和粘附蛋白向適當組織的傳遞。特定的相互作用允許功能性EV內容物的轉移，這些內容物可以改變細胞外基質成分的表達以調節細胞功能，例如細胞增殖、遷移和器官形態發生。例如，在源自骨髓或基質干細胞的EV中發現的某些miRNA內容物已被證明可調節成骨細胞分化以促進成骨細胞活性和骨再生。內皮EV在優化組織功能方面發揮著重要作用，確保它們的內容物到達特定部位以響應生理信號和刺激以維持動脈分化。有許多內皮譜系細胞依賴miRNA和蛋白質EV內容物來指導器官發育和功能。在大腦中，星形膠質細胞衍生的EV含有促進神經突生長、神經元存活和突觸傳遞的蛋白質。盡管過去十年主要集中在支持EV作為細胞間通訊器的關鍵作用的研究上，但現在有證據支持EV作為細胞垃圾袋的原始假設。去除有害細胞內容物是維持細胞穩態所需的重要生物學過程。對于病理生理環境尤其如此，例如在錯誤折疊的蛋白質在神經元內積聚的神經退行性疾病期間。然而，作為生理維持的一部分，EV有助于去除有害的細胞質DNA，作為正常細胞的自衛機制。EV分泌受損的自身DNA可能與自噬介導的DNA向溶酶體的遞送平衡，以供DNASE2A（一種溶酶體核酸酶）降解。隨著我們對疾病系統內EV分泌和攝取的平衡行為有了更好的了解，研究人員可能會重新審視EV在生理廢物清除中的作用。通過觀察為治療而設計的外源性EV內容物的非生理劑量的吸收或去除，可能會發現這一作用的一些線索。免疫系統通過發起涉及非免疫和免疫相關細胞的反應來防御病毒或細菌感染。通常，抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞(DC)、B細胞和巨噬細胞通過細胞表面蛋白直接與T細胞和自然殺傷(NK)細胞相互作用，以調節免疫反應。已發現由抗原呈遞細胞分泌的EV表達相同的細胞表面蛋白，例如MHC1類和II類分子，并且可以充當“抗原呈遞EV”。蛋白質組學研究表明，除了細胞因子、補體因子、免疫調節miRNA、免疫抑制內容物和其他活性分子，EV還可以攜帶促炎和抗炎受體和配體。可以使用ExoCarta數據庫(//www.exocarta.org/)挖掘抗原呈遞EV的蛋白質組分析。在內化后，miRNA和蛋白質等各種內容物可以在病毒感染期間提供保護，防止細胞凋亡，而包裝在受感染EV中的其他病毒因子可以操縱宿主受體細胞以使其自身利益最大化傳播。在細菌感染期間，巨噬細胞可以釋放EV以潛在地允許攝取分枝桿菌mRNA并激活巨噬細胞或CD8+和CD4+T淋巴細胞以引發針對分枝桿菌感染的免疫反應。EV代表了生理細胞間通訊的重要介質，但它們也參與疾病，從功能失調的細胞中傳播病理內容物。EV的分泌與癌癥侵襲性、轉移和疾病進展的增加相關的發現加速了對EV在疾病中作用的研究。下面將討論EV在癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病中的新興作用。盡管EV在其他疾病中也有作用，包括感染和自身免疫性疾病，但這些已在其他地方得到很好的綜述，因此這里不討論。腫瘤衍生的EV可以加速腫瘤生長并促進轉移，同時操縱支持組織以創造最佳的腫瘤微環境（圖2）。圖2. EV在癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病中的作用。過去十年提供了越來越多的證據，證明腫瘤衍生的EV含有功能性癌蛋白和致癌RNA，它們參與模擬原發性腫瘤特征的轉移前生態位的產生。當它們與原發性腫瘤共享一條血管路徑時，可以預測繼發性轉移部位，因為腫瘤衍生的EV在淋巴系統或血流內傳播并進入遠處器官的血管床。腫瘤衍生EV的器官向性也可以通過檢測它們的整合素表達譜來預測，這可以確定它們在特定遠處器官中的靶細胞。轉移性腫瘤的定植是一個高效的過程，其中EV起著至關重要的作用。研究腫瘤衍生的EV以了解它們的致病作用提出了各種挑戰。現在越來越多的證據表明，EV的各種亞群可能會產生一系列不同的影響。潛在地，包含不同致瘤成分的EV的幾個亞群可以協同工作以逃離起源部位，侵入鄰近組織并建立次要部位。例如，在EV中發現的Wnt家族蛋白，特別是Wnt10b的顯著增加，可以誘導上皮-間質轉化以允許腫瘤侵襲。同時，含有磷酸化表皮生長因子受體(EGFR)的微泡-一種通過促進腫瘤微環境在各種癌癥中發揮主要作用的生長因子-可以在抑制頭頸癌中發生的膜聯蛋白A后分泌組織。此外，腫瘤來源的微泡的血管內皮生長因子(VEGF)已被證明可刺激鄰近細胞中的血管生成和腫瘤生長。不同群體的EV也可能被特定細胞吸收。例如，觀察到胰腺導管腺癌產生的EV優先被位于肝臟中的巨噬細胞攝取。這些由胰腺導管腺癌產生的EV的攝取提供了一個轉移前的環境，該環境將骨髓來源的細胞遷移到肝臟并上調TGFβ，從而導致纖維化的激活和進一步的腫瘤負荷。EV可能選擇性地包裝促進癌癥的內容物的方式以及它們的內容表達如何在癌癥發展中發生變化仍未解決。可能是癌細胞能夠失調ESCRT通路以增加EV分泌，從而導致癌癥EV分泌分子的上調。事實上，從原發性腫瘤部位開始，EV可以通過ESCRT介導的途徑協調致癌因子向非致瘤性鄰近細胞的細胞間轉移。原癌基因c-src（控制細胞生長、粘附和遷移）可以與ALIX相互作用以募集ESCRT介導的ILV形成并被封裝到EV中，從而增加EV釋放以促進腫瘤生長。ALIX的缺失已被證明會導致EV相關的程序性死亡配體1(PD-L1)減少，從而導致乳腺癌體內模型中腫瘤相關免疫抑制的減少和進一步的腫瘤生長。沉默ESCRT-III組裝組分CHMP4B和VPS4A可減少β-catenin釋放到EV中，從而抑制肝細胞癌的細胞遷移和轉移。進一步研究ESCRT通路介導促癌蛋白包裝的機制可能有助于制定治療策略。在支持腫瘤生長的腫瘤衍生EV中發現的致癌因子數量是壓倒性的。已證明從原發性膠質母細胞瘤細胞分泌的腫瘤衍生EV（50-500納米）被人腦微血管內皮細胞吸收并誘導血管生成，可能通過轉移富含血管生成蛋白（如血管生成素、白細胞介素）的膠質母細胞瘤微泡內容物IL-6和IL-8。EV中的致癌因子還可以誘導基質細胞的增殖，從而為營養支持提供結締組織和血管。據報道，多種腫瘤支持細胞因子如SDF1、VEGF、CCL5和TGFβ的表達在脂肪。這些細胞因子的轉移觸發了TGFβ受體I和II的表達，從而導致SMAD2的磷酸化和肌成纖維細胞、腫瘤相關基質細胞的分化。EV也可以與RNA和小RNA一起包裝。EV小RNA，尤其是miRNA，在受體細胞中發揮作用，它們每個都可以有許多mRNA靶標并調節多個生物學途徑。例如，據報道，表現出KRAS突變的結直腸癌細胞通過攝取富含miRNA（miR-100、miR-10b、miR-320a和miR-320b）的EV來影響健康細胞，這可能反過來誘導參與細胞生長和遷移的蛋白質的表達。在另一項研究中，發現在前列腺癌干細胞分泌的EV中高表達的miR-100-5p和miR-21-5p在與正常成纖維細胞一起培養時參與形成轉移前生態位和增加遷移。此外，據報道，含有miR-21、miR-378e和miR-143的EV參與刺激乳腺癌細胞的上皮-間質轉化表型。盡管需要進一步研究，但鑒定出的各種miRNA最有可能協同作用以促進上皮間質轉化、增加遷移和侵襲、促進轉移前的生態位并最終在癌細胞中產生侵襲性表型。關于研究功能性mRNA，Valadi等人的里程碑式文章證明外泌體mRNA可以潛在地在受體細胞中轉移和翻譯。由于缺乏可靠的讀出系統來跟蹤EV內容物的轉移和交付，因此很少有后續研究發表。由于缺乏可靠的生物測定，許多人尋求結合體內和體外工作以及臨床樣本的支持證據來驗證關鍵EV mRNA候選者的功能。使用卵巢癌原位小鼠模型發現ES-2細胞是一種高度快速轉移的卵巢細胞系，可促進體內轉移。在ES-2 EV中發現的關鍵分子是MMP1，它在卵巢癌患者的腹水中也非常豐富。對從患者腹水中分離出的含有不同MMP1表達水平的EV進行處理，會導致相關水平的半胱天冬酶活性升高，從而導致間皮細胞凋亡和潛在的癌癥遷移。最近，新的細胞系統已被應用于挑戰EV介導的miRNA和mRNA轉移的假設。高度轉移性癌癥，如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結腸癌和腎癌，最終會擴散到通常受到血腦屏障(BBB)保護的大腦。盡管關于EV如何繞過BBB的研究很少，但由于體外建模BBB的復雜性，一些見解開始出現。與內皮細胞層一起發現的星形膠質細胞在調節BBB通透性中起主要作用并且已被證明可提供失調的星形膠質細胞EV含量以促進腦轉移性癌癥。PTEN是一種腫瘤抑制因子，通過轉移PTEN靶向miRNA(miR-19a)在腦轉移性腫瘤細胞中丟失，發現其在星形膠質細胞衍生的EV中顯著上調。此外，為了進入大腦，腫瘤衍生的EV已被證明通過轉移miRNA種類來分解BBB，這些miRNA種類靶向與緊密連接和肌動蛋白重塑相關的蛋白質的翻譯。發現miR-181c在來自高度轉移性人乳腺腫瘤細胞的EV中升高，這導致其靶標PDPK1下調，從而導致肌動蛋白動力學重組以允許外滲。此外，miR-105下調緊密連接蛋白ZO1，并在從癌癥衍生的EV遞送時破壞內皮單層的屏障功能。從歷史上看，從突觸前神經元到突觸后神經元分泌的突觸小泡被描述為大腦神經網絡內神經元通信的主要方法。EV可以從神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞中釋放出來，代表了一種通過蛋白質和基因組物質轉移進行神經元內通訊的新方法（圖2）。EV及其內容物從一個神經元到另一個神經元的跨突觸轉移可能涉及生理神經元通訊，但在神經退行性疾病的情況下，也可能涉及將病理蛋白質傳播到鄰近的健康神經元。此外，已在神經退行性疾病中觀察到EV介導的BBB分解。神經病理學蛋白質的錯誤折疊和聚集是神經退行性疾病的標志。在過去十年中，EV已被證明含有多種神經病理學蛋白，如淀粉樣前體蛋白(APP)和Aβ、朊病毒蛋白(PrP)、α-突觸核蛋白、SOD1和tau。傳染性朊病毒(PrPSc)是一種可傳播的病原體，可導致動物瘙癢病和幾種家族性和散發性朊病毒病，例如人類的克雅氏病(CJD)。EV對朊病毒病的研究已引領神經退行性疾病領域研究EV在腦部疾病中的作用。朊病毒蛋白的傳染性提供了一個可靠的體外和體內系統，通過利用檢測受體細胞中是否存在感染的能力來研究EV在神經退行性疾病中的作用。傳染性朊病毒在大腦中的傳播被認為是由EV介導的，兩項初步的體外研究表明，朊病毒感染系分泌的外泌體對幼稚細胞具有感染性。此外，用刺激EV釋放的離子載體莫能菌素處理朊病毒感染的細胞，增加了幼稚細胞的朊病毒感染性。隨著EV研究的發展，該領域觀察到一種“朊病毒樣”傳播，所有錯誤折疊形式的神經病理蛋白都存在，EV可能在將神經毒性蛋白從一個大腦區域傳播到另一個大腦區域中發揮作用。根據AD和帕金森病(PD)的分期分類，隨著疾病的進展，從一個相鄰區域到下一個區域觀察到病理擴散的模式和預測性質。從患有AD和路易體癡呆(DLB)的患者死后組織中分離出的腦源性EV被發現在小鼠顱內注射后加速磷酸化α-突觸核蛋白和tau的細胞內積累。最初使用從突變tau轉基因小鼠大腦中分離出的EV進行了類似的研究，在tau病小鼠模型中觀察到這些EV加速了注射部位的tau過度磷酸化。目前，還沒有確鑿的研究表明EV是否可以在大腦內相互連接的神經元之間移動。盡管大多數研究都集中在EV中包含的神經毒性蛋白，但少數研究調查了神經退行性疾病中失調的miRNA。大多數miRNA研究都集中在臨床血清或血漿中生物標志物的開發。盡管如此，已在感染朊病毒的細胞系分泌的外泌體中發現了miRNA的譜，最近有報道稱各種miRNA在AD細胞模型分泌的EV中富集。此外，一個使用良好的肌萎縮側索硬化癥(ALS)細胞模型被證明可以分泌富含miR-124的CD63+EV，這導致受體小鼠小膠質細胞中產生MMP-9等炎癥介質，并有可能增強神經炎癥和運動神經元變性。miRNA譜也已在從“健康”和AD死后腦組織中分離的腦源性小型EV中得到表征。有趣的是，與對照組相比，從AD受試者分離的腦源性EV中miRNA表達的方向與在AD受試者的外周血清EV中檢測到的方向相反，這表明腦生物標志物可能不存在于血液中。然而，一些“大腦特異性”miRNA種類在兩種組織中都大量表達，表明它們具有作為AD生物標志物的潛在應用。從死后腦組織中分離腦源性EV的能力為進一步研究腦源性EV是否也在神經退行性疾病的病理傳播中發揮作用提供了可能性。然而，在對組織衍生的EV制劑進行此類分析時，重要的是要考慮細胞死亡后釋放的細胞內囊泡的潛在污染。來自不同細胞來源（如內皮細胞、平滑肌細胞、血小板和白細胞）的EV被釋放并在血液中循環，在那里它們可能導致動脈粥樣硬化和心血管疾病等外周疾病（圖2）。動脈粥樣硬化是一種由于脂質和膽固醇形成的斑塊積聚而導致動脈變窄的疾病。通常，動脈粥樣硬化發生在心血管疾病的初始階段，導致動脈粥樣硬化病變、內皮細胞功能障礙、收縮心肌喪失和心肌梗塞，這可能是嚴重的或被證明是致命的。正如所討論的，EV，特別是微泡或大型EV已被證明在動脈粥樣硬化病變的發生和進展中起作用。然而，它們現在正被用于提供潛在的心臟再生療法。抗動脈粥樣硬化區域經歷微泡樣囊泡的生理起泡（90-400?nm），這維持了質膜上磷脂的平衡分布。在動脈粥樣硬化易發區域，由于細胞死亡，會發生微泡或更大的EV脫落，這會導致磷脂失衡和平滑肌細胞的改變。來自缺氧心肌細胞的EV含有凋亡因子，如HSP60和TNF，它們會引發細胞死亡，并且在攝取后對受體心肌細胞有害。為了進一步加劇血管損傷，來自血小板和白細胞的EV提供促炎和抗炎細胞因子，如TNF、IL-6、IL-8和IL-1β來刺激炎癥，導致內皮功能失調。此外，EV通過上調ICAM1、VCAM1和E-selectin等粘附分子促進單核細胞與內皮細胞的粘附。單核細胞向病灶的募集進一步誘導細胞凋亡和EV額外釋放到動脈粥樣硬化斑塊中，導致潛在的斑塊破裂。新發現引發了對心肌梗死后利用基于MSC的治療促進血管生成和恢復心臟功能的潛力的研究。然而，基于MSC的治療的重點已經轉移到使用MSC衍生的EV，因為它們被發現含有豐富的內容，可以刺激內皮細胞的遷移和血管生成。例如，來自人骨髓來源的MSC的EV下調了白細胞與內皮細胞的粘附，這可能用于最大限度地減少內皮的進一步損傷。同樣，內皮細胞衍生的EV，例如來自人類微血管內皮細胞的EV，被發現會分泌含有miR-214的EV，從而刺激鄰近靶細胞中的血管生成。其他發現富含內皮細胞衍生EV的miRNA已被證明可靶向抗炎和抗血管生成基因。鑒于EV具有攜帶致瘤或神經毒性因子并在細胞之間轉移這些因子的能力，抑制EV的形成、釋放或攝取可能會降低囊泡介導的發病機制的負荷（圖2）。是否有更多的囊泡釋放發生在疾病存在是有爭議的，研究團隊報告沒有變化，疾病中更多的釋放或反之亦然。正在探索治療靶向EV的三種主要方法：(1)通過靶向nSMase2途徑抑制EV釋放，(2)通過靶向ESCRT機制的組分抑制EV釋放和(3)抑制病理性EV的攝取通過受體細胞。然而，確定專門針對致病性EV與生理維持和交流所需的健康EV的化合物和方法是一項關鍵挑戰。GW4869（靶向nSMase2）等藥理學EV抑制劑已被用于研究抑制EV釋放的效果。例如，用莫能菌素處理朊病毒感染的細胞會增加EV的釋放，這與朊病毒的細胞間傳播相關，并且被GW4869逆轉。進行了類似的實驗來研究結腸直腸癌細胞衍生的EV，它們在體內誘導結腸癌細胞的增殖和抑制細胞凋亡；用GW4869治療后腫瘤生長受到抑制。在從表達人類突變體tau的AD小鼠模型培養的原代小膠質細胞中，GW4869或靶向nSMase2的siRNA也抑制了Tau通過小膠質細胞衍生的EV傳播。此外，在AD的5XFAD家族性小鼠模型中，GW4869與預期一樣顯著降低了神經酰胺水平，從而導致腦源性EV水平和血清EV分泌降低。雖然EV仍然可以從替代途徑分泌，但該研究表明，對nSMase2的藥理學抑制能夠減少體內AD大腦中的淀粉樣蛋白負荷和斑塊負荷。本研究的后續研究產生了nSMase2缺陷型5XFAD小鼠，與5XFAD小鼠相比，其腦組織中神經元衍生的EV分泌顯著減少。nSMase缺陷小鼠的EV分泌減少通過減少淀粉樣蛋白負荷和tau磷酸化來規避AD病理學的進展，這改善了5XFAD小鼠模型的認知能力。需要更多的研究來進一步探索靶向nSMase2以減少EV釋放的潛力。必須調查GW4869的潛在脫靶效應。例如，據報道，GW4869除了對nSMase2的抑制作用外，還具有脂質結合特性。此外，SMase2的細胞表達差異可能會帶來額外的挑戰。Cannabidoil是一種具有抗炎和抗腫瘤活性的抗焦慮藥，而氯脒是一種不可逆的pan-PAD抑制劑，已被證明可以抑制幾種癌細胞的EV釋放。與氯脒相比，大麻油在癌細胞中更有效地抑制100–900nm囊泡的釋放。其他EV抑制劑，如細胞松弛素D、格列本脲和氯丙嗪，可減少大小大于150納米的囊泡的釋放。這些化合物通過破壞細胞骨架來抑制EV的釋放，導致癌細胞對甲氨蝶呤等癌癥藥物的敏感性增加。大多數這些研究是使用癌細胞系進行的并且尚未在小鼠模型中得到驗證。ESCRT機制的靶向組件可用于抑制致病性EV的釋放。該領域仍處于起步階段，因為可能需要針對ESCRT機器的多個組件及其輔助蛋白。然而，據報道，在朊病毒疾病的細胞模型中敲除HRS會抑制朊病毒蛋白的釋放，從而抑制感染性。沉默ESCRT-I復合物的一個成分TSG101證實了傳播是通過EV分泌介導的。癌細胞利用經典的外泌體途徑來驅動腫瘤存活，一些研究已經觀察到免疫抑制作用和/或通過消耗ESCRT的成分來減少腫瘤生長。ALIX負責ILV中的內容物摻入，可以敲除以改變癌細胞中釋放的EV的組成。來自ALIX敲低乳腺癌細胞系的EV的蛋白質組學分析顯示，與對照相比，12種蛋白質顯著下調。一種特殊的蛋白質PD-LI在腫瘤相關免疫抑制中具有重要作用，它保留在MVB中，而是在ALIX敲低細胞中被募集到質膜中。這種失去ALIX后的抗腫瘤免疫反應在乳腺癌的體內小鼠模型中得到了驗證。在另一項研究中，需要用帶電多泡體蛋白4B(CHMP4B)抑制ALIX二聚化，以確保顯著降低EGFR等蛋白質的MVB/ILV分選。此外，通過小發夾RNA(shRNA)敲低RAB27A可減少人肺腺癌細胞中EV的分泌，這可能有助于抑制EV衍生的金屬蛋白酶和與肺腺癌相關的腫瘤衍生的EV miRNA的釋放和攝取，從而導致減少在原發性腫瘤生長中。雖然工程細胞來擊倒ESCRT機制可能更具體，但使用藥理學抑制劑可能是一種更實用的方法。癌癥藥物的高通量篩選確定了替比法尼能夠抑制轉移性去勢抵抗性前列腺癌細胞中的ESCRT依賴性Alix和ESCRT非依賴性nSMase2外泌體生物發生。在同一項研究中發現的其他抑制劑包括奈康唑、酮康唑和攀登唑，所有這些都通過抑制Alix表達來減少EV的釋放。應該指出的是，抑制內質溶酶體功能障礙是原因的神經退行性疾病中的EV釋放可能導致神經毒性蛋白的積累并加速病理。例如，在唐氏綜合征患者中，CD63的敲低導致內體異常，而RAB27A的沉默導致有毒蛋白TARDNA結合蛋白43(TDP43)在神經元中的積累，這是ALS的標志。Rab27a敲低也被證明表現出脫靶效應，敲除小鼠表現出中性粒細胞和血小板釋放顆粒的缺陷。RAB27A細胞表達水平的差異也可能帶來治療挑戰。抑制EV介導疾病傳播的另一種潛在方法是通過阻斷EV攝取途徑。然而，由于涉及的復雜性和多種機制，例如網格蛋白依賴和網格蛋白非依賴途徑的內吞作用、血漿或內體膜融合、吞噬作用，EV的吸收仍在進行深入研究，并且假設不斷被審查。和微胞飲作用。由于顯微鏡的限制，也很難確認內化和吸收程度。然而，一些研究提供了有希望的發現。例如，一種dynamin抑制劑dynosore可通過網格蛋白介導的途徑減少轉鐵蛋白的內化，觀察到顯著抑制來自EBV感染的B細胞的標記CD63+EV向EBV陰性上皮細胞的攝取和內化。此外，使用dynosore也抑制了從人類惡性黑色素瘤細胞系分泌的腫瘤衍生EV（膜聯蛋白V+）的內化，進一步觀察到這導致腫瘤血管生成減少。EV研究中一個快速增長的興趣領域是EV作為診斷生物標志物的潛在應用。在當前基于組學的技術時代，已在從生理和疾病環境中分離出來的EV中鑒定出大量蛋白質、核酸、脂質和聚糖。盡管這些研究具有良好的預后和診斷潛力，但很少有人進入臨床。EV研究人員，主要是在學術實驗室內，投入了大量精力來分析潛在的EV生物標志物。然而，大多數學術實驗室在確定和確保處理生物樣本的分析前程序遵循與病理學實驗室認證相關的法規方面經驗不足。在一個相對較新的領域滿足通用標準具有挑戰性，因為研究人員仍在開發在固有平臺差異和驗證不一致之間進行EV分離的方法。最近市場上大量商業EV分離試劑盒加強了EV生物標志物的研究，并促進了潛在EV生物標志物的臨床前開發和轉化（表1）。從各種癌癥的細胞和小鼠模型中分離出的EV已被分析和審查。然而，該領域僅通過ExosomeDiagnostics針對前列腺癌、肺癌和與癌癥相關的各種突變（如EGFR/MAPK和PI3K2,169,170,171）的測試（表2）成功地將EV生物標志物轉化為臨床。與癌癥相關的mRNA基因片段在血液中以高豐度循環，這些片段可能包含在EV中，因此很容易使用分子生物學方法檢測到。此外，循環腫瘤DNA也可以由致瘤性凋亡細胞釋放，并用于開發癌癥生物標志物。ExosomeDiagnostics的成功可能是因為他們能夠使用他們專門設計的EV分離試劑盒來富集這些RNA標記物，還因為他們在多個地點進行了大規模的臨床驗證研究，以改進他們的診斷算法。其他致癌突變也具有用作EV RNA生物標志物的潛力。例如，在分離血漿EV后，80-85%的晚期和轉移性胰腺導管腺癌患者可以檢測到KRAS突變。此外，通過qPCR在患者中檢測到與黑色素瘤有關的BRAFV600突變，該突變與從淋巴引流中獲得的滲出性血清分離的EV中發現，靈敏度為95%。其他投資于癌癥EV診斷的公司包括Exosomix、CarisLifeSciences和NXPharmaGen，它們正在開發針對與腦癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌相關的突變或單鏈核苷酸的EV測試。在神經退行性疾病中，大多數基于EV的檢測仍處于生物技術公司或學術實驗室的驗證階段。NanoSomix使用神經衍生的EV，檢測到與AD相關的蛋白質的平均比率存在顯著差異，例如磷酸化1型胰島素受體底物、神經突蛋白2α(NRXN2α)、含GluA4的谷氨酸(AMPA4)受體、神經膠質素1(NLGN1)的水平、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ1-42在AD患者中與病例對照相比，并證明它們可用作臨床前AD的血液生物標志物。此外，一項于2016年完成的臨床研究旨在測試檢測磷酸化LRRK2的臨床效用，LRRK2是一種與PD中觀察到的病理特征相關的PD相關基因，例如α-突觸核蛋白的蛋白質包涵體的積累。從具有致病性LRRK2突變的PD患者的尿液中分離出的EV中發現LRRK2顯著升高。ExosomeSciences目前正在與美國各個國家橄欖球聯盟合作，以驗證他們基于血漿EV ELISA的檢測方法，該檢測方法可檢測EV中的tau蛋白(TauSome)，可用于診斷患者，尤其是運動員的慢性創傷性腦病。ExosomeSciences計劃將TauSome檢測應用于其他神經系統疾病，如AD。除了基于蛋白質的檢測外，還有各種有前途的EV血液檢測方法，它們在檢測與AD和PD相關的EV miRNA方面表現出高靈敏度和特異性。例如，發現一組16種miRNA在AD患者的血清EV中失調，這與腦成像、神經心理測量測試和APOE?4基因分型等其他診斷方法相關，并提供了87%的敏感性和77%的特異性在他們的驗證研究中預測AD。一項后續研究表明，這些miRNA生物標志物中的一些也存在于從AD患者死后大腦中分離的額葉皮層衍生的EV中。這些發現表明，如果可以確定與疾病病理學有關的EV內容物，則從外圍分離EV可以深入了解大腦的退化程度。類似的研究確定了與AD相關的其他EV miRNA面板，具有相似的準確性。這些研究證明了使用EV miRNA作為與其他生物標志物的補充工具作為AD預篩選的潛在可行性。但是，我們還沒有看到這些診斷測試是否會進入臨床。EV的生物學功能使其適合開發為幾種情況的潛在治療劑（圖3）。這是目前一個非常活躍的研究領域，學術團體和公司正在研究使用天然EV制劑（例如由細胞直接分泌的制劑）、將內容物分子裝載到EV中的潛力以及仿生囊泡的使用（表3）。這些方法中的每一種都有其自身的挑戰，這反映了EV表征和操作的技術能力。此外，目前還沒有明確的EV療法監管框架，盡管它們可能屬于生物制品的藥物類別。一種治療藥物要獲得臨床批準，需要證明其藥代動力學和治療功效，而這些目前在EV領域還處于起步階段。幾項體內研究表明，各種來源的EV具有治療潛力。這些包括間充質干細胞、樹突狀細胞、源自血漿的EV和仿生納米囊泡。心臟球衍生細胞也是用于治療心血管疾病的EV的來源，目前CapricorTherapeutics正在進行I期臨床試驗。MSC可以來自多種來源，包括臍帶血、骨髓、牙髓和脂肪組織。使用MSC進行了許多臨床試驗，并且MSC已被證明在細胞治療方法中具有良好的耐受性，但人們認為觀察到的MSC的治療效果來自分泌因子，而不是細胞本身。這導致人們非常關注使用源自MSC的EV作為潛在的治療劑。MSC衍生的EV已用于多種疾病模型，主要是因為它們具有免疫調節潛力。MSC衍生的EV的應用可能會克服與使用這些細胞相關的一些安全問題，因為它們不能形成腫瘤，盡管這種潛力尚未得到很好的表征。MSC衍生的EV已在心肌缺血/再灌注損傷、中風和乳腺癌模型中顯示出療效。在心肌梗塞模型中，MSC衍生的EV減少了梗塞的大小和細胞凋亡分子標志物的誘導。隨后的研究表明，MSC衍生的EV的心臟保護作用可以通過miR-22和miR-221等miRNA的作用來介導，這表明囊泡的RNA內容物可能對治療作用很重要。同樣，含有miR-133b的MSC衍生的EV改善了中風大鼠模型的恢復。此外，MSC衍生的EV在小鼠局灶性腦缺血模型中的應用表現出積極作用，增加了血管神經生成，從而產生了長期的神經保護作用。MSC衍生的EV顯示出與MSC細胞相似的功效。使用MSC衍生的EV進行的人體研究包括治療一名患有移植物抗宿主病的患者，沒有發現明顯的副作用，并且癥狀在幾個月內有所下降。通過測量血液中促炎和抗炎細胞因子水平來監測治療，觀察到幾種促炎細胞因子（包括IL-6、IL-8和IL-17）的水平顯著降低。慢性腎病是另一種人類疾病，已在人體中進行了試驗。源自臍帶組織MSC的EV用于治療患有長期慢性腎病的患者。在治療組中觀察到癥狀有所改善，抗炎細胞因子水平降低，在治療后12個月進行測試時效果持續存在。使用源自DC的EV也顯示出治療前景，并且由于它們的免疫調節功能有可能針對多種疾病。DC衍生的EV可用于（通過刺激免疫系統的EV）接種結核病和弓形蟲感染等傳染病。使用這種方法類似地測試了在分枝桿菌外膜囊泡中釋放的其他分枝桿菌抗原。已開發出多種外膜囊泡疫苗，并成功獲得了針對腦膜炎雙球菌血清群B（導致腦膜炎球菌疾病）的許可，例如VA-MENGOC-BC、MenBvac、MeNZB和Bexsero，這些疫苗在兒童中和成年人的有效性超過70%。這些疫苗為預防金黃色葡萄球菌等其他主要分枝桿菌感染提供了希望。S.?aureus釋放含有毒力因子（如腸毒素、IgG結合蛋白和溶血素）的EV，發現EV在骨髓來源的DC中引發免疫原性反應，并在S.?aureusEV免疫的小鼠中誘導保護性免疫。此外，感染登革熱病毒的單核細胞衍生的DC釋放含有與免疫反應相關的mRNA和miRNA的EV，以及可用于開發疫苗的病毒顆粒。DC衍生的EV（有時稱為“dexosomes”）也已作為潛在的抗癌疫苗進行了研究，并且大量正在進行臨床試驗。這種方法利用了DC衍生EV的分子特性，因為它們含有DC上存在的免疫刺激因子，并且可以通過位于囊泡外部的肽-MHC復合物呈遞抗原。迄今為止，大多數已完成的臨床研究報告了對癌癥患者的合理安全性，并具有輕度至中度的副作用，例如流感樣癥狀。與MSC衍生的EV一樣，這些囊泡的使用降低了與細胞療法相關的風險，包括促腫瘤活動。DC衍生的EV來源于單核細胞衍生的DC的自體培養。迄今為止，大多數已完成的臨床研究都顯示出適度的反應，例如低水平的T細胞反應，與NK細胞刺激有關。一項臨床試驗為轉移性黑色素瘤患者接種了含有MHCII類肽的DC衍生EV，這在一名患者的腫瘤區域募集了激活的T細胞反應，而試驗中的其余患者顯示出最小的反應。在非小細胞肺癌患者的另一項I期試驗中也觀察到了類似的適度反應，其中四分之二的患者表現出NK活性。這些發現表明，可能需要對DC衍生的EV進行設計或操作，以提高其引發所需免疫反應的能力。先天免疫反應的一個關鍵機制是干擾素基因刺激物(STING)通路，它可以產生腫瘤特異性T細胞反應。含有STING通路激動劑的工程EV正在探索作為一種潛在的抗癌療法，目前正處于I期臨床試驗(CodiakBiosciences)。源自血漿的EV也被用作潛在的治療劑，特別是用于再生應用。富含血小板的血漿，濃度高于生理學在全血中發現的濃度，并且是用于這些治療的EV的來源。從富含血小板的血漿中分離出的EV富含由其來源的血小板產生的生長因子（如血小板衍生生長因子、轉化生長因子-β和血管內皮生長因子）。初步研究表明，從血小板裂解物中分離的EV以劑量依賴性方式增加了骨髓來源的MSC的增殖和遷移特性，將血小板裂解物中所見的影響歸因于這些制劑中包含的EV。一項研究糖尿病嚙齒動物模型傷口愈合的研究證實了源自富含血小板的血漿的EV具有由囊泡中所含生長因子介導的增殖和遷移效應的進一步證據。此處證明，使用源自富含血小板血漿的EV治療的傷口愈合速度明顯快于未治療或使用富含血小板血漿本身治療的傷口。使用EV作為治療劑的優點之一是它們在自體使用時表現出低水平的免疫原性，從而限制了潛在的副作用。它們的大小和脂質膜成分使它們成為與靶細胞融合的理想選擇，它們可以在其中運送內容物，同時避免降解。它們還具有優于固有毒性的合成納米顆粒（例如脂質體）的優勢。這些特性導致開發了向EV裝載治療性內容物以治療多種疾病的方法。將內容物裝載到EV中的方法包括操縱原始細胞以過度表達特定的內容物，使用電穿孔物理摻入小功能RNA，或對細胞本身進行化學處理。通常情況下，miRNA和siRNA已被加載到EV中，其中可以使用基于熒光素酶基因表達的測定來驗證是否傳遞到受體細胞中。從血漿中本地生產的EV也可以被修改以包含治療性內容物。這方面的一個例子是使用電穿孔將治療性抗腫瘤miRNA摻入從人血漿中分離的EV中，然后顯示其促進人腫瘤細胞系的凋亡。比miRNA和siRNA大的核酸（如線性DNA）可以通過電穿孔以每個囊泡數百個分子的數量加載。然而，已觀察到線性DNA的限制約為750–1,000個堿基對或質粒DNA分子范圍為4.5kb至10kb，增加長度的效率較低。必須控制的另一個挑戰是發現電穿孔會導致核酸聚集體的產生，從而降低吸收效率和裝載內容物的影響。操縱親代細胞過度表達治療性內容物是裝載小型EV的常用方法。這種方法在很大程度上依賴于確保感興趣的內容物通過外泌體生物發生途徑裝載到EV中。使用模擬物過度表達miRNA是一種常見的方法，它會導致EV分泌額外的外源miRNA。例如，過表達miR-146a的DC產生富含miR-146a的EV，這些EV在重癥肌無力小鼠模型中具有抗炎作用并降低CD80和CD86水平。此外，過表達miR-146b的骨髓基質細胞分泌的含有miR-146b的EV能夠減少原發性腦腫瘤大鼠模型中膠質瘤異種移植物的生長。然而，其他研究表明，其他miRNA，如miR-124、miR-145和miR-454-3p，也可以抑制神經膠質瘤細胞。文獻中觀察到對一種特定癌癥具有抗腫瘤作用的miRNA的數量對其對疾病的特異性產生了不確定性；這個問題不僅限于癌癥，而是涉及所有情況。使用納米技術將EV靶向特定組織以獲得方向控制也已被用于整合RNA適體，附著在噬菌體phi29馬達包裝RNA上，該RNA顯示在EV表面，作為與癌癥過度表達的特定受體結合的配體細胞。與神經元特異性RVG肽融合的溶酶體相關膜糖蛋白2(LAMP2)等表面分子的表達已成功用于在AD小鼠模型中將含有siRNA內容物的EV遞送至大腦。含有針對致癌Kras的siRNA的EV也已被設計并顯示可抑制小鼠的胰腺癌。EV也可用于遞送mRNA內容物，例如HChrR6基因，該基因編碼一種人源化大腸桿菌酶，該酶參與轉化導致DNA嵌入的細胞毒性藥物。用編碼HChrR6的mRNA轉染各種細胞系被證明具有積極作用，例如幾乎完全阻止乳腺癌異種移植物上的腫瘤生長。在表達KrasG12D的人胰腺原位腫瘤小鼠模型中，從MSC分泌并用對致癌突變KRASG12D特異的siRNA（稱為iExosomes）進行電穿孔的EV（CD9+、CD63+和CD81+）的臨床級生產將腫瘤生長抑制到幾乎無法檢測到的水平。其他方法包括將LAMP2與神經元特異性RVG肽融合在一起的EV工程，以實現跨BBB的轉移并靶向神經元、小膠質細胞和少突膠質細胞，這些神經元、小膠質細胞和少突膠質細胞可以裝載內容物以靶向AD。還表明，心臟球衍生的EV具有促進心肌細胞存活和增殖的血管生成特性，這是一種正在開發的方法來再生受傷的心肌。其他使用改良EV作為治療方法的方法包括使用含有腺相關病毒載體的EV向耳蝸毛細胞提供基因治療解決方案，以治療聽力障礙。EV也可以被設計來傳遞目標蛋白。NDFIP1被確定為參與將蛋白質加載到EV中，這是通過用NDFIP1識別的WW標簽標記目標蛋白來利用的，從而將目標蛋白加載到EV中。第一個用作證明原理的蛋白質是Cre重組酶，一旦被受體細胞內化，它也被用作報告蛋白。WW-CreEV的鼻腔給藥導致整個大腦細胞的正攝取，這表明這些工程化的EV可能對神經系統疾病有用。其他人將腫瘤相關抗原融合到乳粘素的C1C2結構域，這是一種脂質結合結構域，可將乳粘素募集到EV。除了細胞衍生的EV外，其他納米粒子也具有作為治療劑的潛力，包括仿生囊泡、脂質體、碳納米管、膠束和樹枝狀大分子等實體。細胞衍生的仿生囊泡可以使用諸如通過特定孔徑過濾器的連續擠出等技術生產。通過這種方式形成的囊泡已被證明與EV具有相似的特性，具有相似的特征，包括它們的大小和膜組成。幾項研究表明，與小型EV相比，功能性模擬EV可以從不同的親代細胞產生100多倍以上的顆粒產量。通過這些方法產生模擬EV的原理是基于細胞膜中存在碎片脂質，這些脂質可以重新組裝形成球形結構并同時封裝周圍的分子。模擬EV的生產涉及三個主要步驟：收獲細胞并在合適的緩沖液中重新懸浮、通過機械力破壞細胞以及純化/富集產生的囊泡。這種生產方法的優勢包括更大規模的生產和在合成過程中將治療分子摻入囊泡中的潛力。這方面的一個例子是將化學治療劑摻入仿生囊泡中，該囊泡在小鼠全身給藥后可以有效對抗惡性腫瘤。迄今為止，仿生囊泡主要保存在學術研究實驗室中，并沒有被公司用于開發治療方法。然而，合成納米囊泡（如脂質體）長期以來一直被用于遞送阿霉素等藥物以靶向癌癥。盡管EV的治療和診斷應用對幾種人類疾病具有很大的前景，但也存在一些相關的挑戰。技術挑戰代表了一個重大問題——從分離方法到臨床適用的EV制劑的表征和標準化。EV及其亞型的分離通常依賴于使用低通量技術，例如超速離心。采用切向流過濾或尺寸排阻色譜等方法的較新方法顯示出能夠從大量培養基中制備EV的前景。擴大細胞培養以生產足夠的EV用于臨床應用也是一項重大的技術挑戰。隨之而來的是與使用生物反應器和使用培養基補充劑（如胎牛血清）相關的問題，胎牛血清本身就含有EV，這證明了表征作為擴大生產的一部分的重要性。分離產品的全面表征需要標準化，特別是必須定義EV在制劑中的功能活動。確定治療性EV的有效劑量甚至作用機制，特別是那些來自干細胞來源的EV，仍然是該領域面臨的挑戰。更深入地了解特定EV制劑的作用方式將有助于開發適當的劑量和功能評估。一旦定義了這些參數，這可以通過增加我們對EV異質性范圍的理解和改進分離協議以豐富具有最大功能活性的囊泡來幫助。開發可以測量特定EV群體功效的效力測定是另一個挑戰。將特定的生物活性歸因于EV以用作治療效力的標記是可能有助于解決此問題的一種方法。此類檢測的開發對于EV療法的監管批準非常重要。關于EV作為藥物輸送劑的應用，一個應該探討的問題是裝載外源性內容物是否會干擾內源性內容物或與內源性內容物相互作用，以及這是否會產生與脫靶效應相關的問題。如果脫靶效應超過治療目標，EV的異質性可能會成為一個重大障礙，尤其是在癌癥等多方面疾病中。例如，幾乎可以肯定的是，在EV中傳遞一種miRNA不會完全解決疾病，可能需要一個miRNA家族來確保下游和上游靶標也在受體細胞中受到調節。就基于核酸負載的EV療法而言，有幾個關于功能性RNA遞送機制的考慮。另一個問題是確定用于EV分離和治療用途的最安全的細胞來源，以避免免疫原性問題并確保EV不會傳遞不需要的有毒內容物。為了解決這些問題，必須建立適當的臨床前模型，并選擇具有所需內容物和分子屬性的EV制劑。同樣，更深入地了解特定EV制劑在治療環境中的作用機制將指導這些參數的選擇。將EV定位到它們將進行治療活動的部位是另一個需要進一步研究的方面。加深對EV傳遞機制的了解將在實現這一目標中發揮作用，并且方法將需要平衡EV的自然加工和降解與將治療有效載荷定位到所需部位。在為針對特定位點的EV設計治療策略時，最大限度地減少脫靶效應也是一個關鍵考慮因素。雖然已經證明了具有增強特定細胞類型的趨向性或能夠通過BBB傳遞到大腦等器官的特性的工程EV，但它們的進一步發展可能會受到生產治療相關數量的這些囊泡的技術挑戰的阻礙。使用與EV外部綴合的小抗體（納米抗體）片段或RNA適體的最新進展表明，在將治療性EV靶向特定位點方面具有一定的特異性。基于EV的生物標志物的開發——無論是基于蛋白質、核酸、脂質還是聚糖——都顯示出巨大的希望，特別是對于癌癥和神經系統疾病等疾病。然而，將基于EV的疾病生物標志物的發現轉化為臨床需要技術進步，特別是對于高通量檢測的開發。例如，開發能夠以高通量方式從許多樣品中快速分離EV的方法將增強基于EV的診斷的使用。跨實驗室方法的標準化也是必不可少的，并且在不同實驗室和不同樣本組中對EV疾病生物標志物進行交叉驗證，將加速基于實驗室的研究結果向臨床的轉化。盡管挑戰不斷，但近年來EV研究領域取得了重大進展。少數基于EV的生物標志物現在用于臨床或研究目的（表2）。此外，越來越多的臨床前研究證明了基于EV的療法在許多重大疾病中的潛力，這為EV療法的臨床開發奠定了基礎，其中少數處于早期開發階段（表3）。進一步的發展將需要擴大生產的技術進步，并獲得相關的臨床使用監管批準。盡管這些技術和監管障礙仍有待解決，但最近對EV生理和病理作用的理解迅速增長，揭示了許多潛在的診斷和治療應用，推動了其巨大臨床潛力的實現。
參考文獻：
Cheng, L., Hill, A.F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov (2022). //doi.org/10.1038/s41573-022-00410-w.
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