從2001年首次發表至今，歷經20余年的發展與沉淀，PROTAC靶向蛋白降解技術的黃金時代已然來臨。2022年1月18日，PROTAC技術的發明人之一，這一革命性領域持續的開拓者、最重要的貢獻者——耶魯大學的Craig Crews教授發表了有關PROTAC技術的最新綜述：，并在其中分析預測未來20年PROTAC技術4大爆發機會點。
1. 序曲的開端：“泛素蛋白”的發現
早在1942年，Schoenheimer通過同位素技術發現蛋白是處于一面被持續地合成出來一面被持續地降解掉這樣一個動態平衡中。蛋白是如何被降解的成為了生物學界持續近半個世紀的研究主題。在1975年，Goldstein首次從牛胸腺中發現了一種只有76個氨基酸的小蛋白。后來發現這個蛋白質廣泛地存在于各種組織和有機體中。這個蛋白因其存在之廣泛（ubiquitous）而被命名為泛素蛋白（Ubiquitine）。在隨后的70s-90s年代，泛素蛋白被發現在蛋白降解中起到了重要的作用。在此期間一系列突破性的發現建立了蛋白降解的主要機制：泛素蛋白-蛋白酶體系統。在E1,E2,E3連接酶的作用下，多個泛素蛋白被轉移到一個需要被降解的蛋白上。被貼上泛素蛋白標簽的目標蛋白進而被蛋白酶體識別，并在蛋白酶體空腔內被降解成多肽片段和氨基酸分子。Aaron Ciechanover, Avram Hershko和 Irwin Rose因發現泛素蛋白介導的蛋白降解而獲得2004年Nobel化學獎。
圖片摘自諾獎官網
在2001年Craig Crews教授及合作者在PNAS上發表了一篇突破性文章。作者們首次提出一個嶄新的概念：PROTAC（靶向蛋白酶解嵌合體分子）。如下圖所示，PROTAC分子由三部分組成:靶點蛋白配體，E3連接酶配體，還有鏈接部分將二者連在一起。
PROTAC分子一端和靶點蛋白相結合，另一端和E3連接酶結合，從而將靶點蛋白和E3連接酶強拉到一起。這樣就促進E3連接酶催化泛素蛋白轉移到靶點蛋白上。被泛素化的靶點蛋白就能被蛋白酶體識別并降解。靶點蛋白承擔的生理功能將隨著靶點蛋白的消亡而消失。通過降解靶點蛋白而調控其生理功能開辟了一條前所未有的生物醫藥研究和制藥新途徑。
圖片摘自：Bekes, M.; Langley, D. R.; Crews, C. M. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat. Rev. Drug Discov. 2022, ahead of print.
盡管設想創意滿滿，但是現實很骨感。PROTAC的概念提出伊始便遭遇重重困難，飽受質疑。盡管靶點蛋白不乏小分子配體，但是E3連接酶的配體研究卻近乎空白。在2001年的這篇PNAS文章中，作者們使用了一個多肽作為E3連接酶的配體。基于多肽的PROTAC分子無法透過細胞膜，缺乏實際應用的潛力。雖然可以通過微注射的技術把多肽類PROTAC化合物送入細胞開展研究，但實用價值幾近于無。在2001年之后的十來年內，跟進這個領域的工作屈指可數。在2008年，Crews課題組發表了靶向雄激素受體（AR）的基于小分子E3連接酶配體的PROTAC。這個工作標志著PROTAC領域的一個突破：基于小分子配體的PROTAC使得改善成藥性成為可能。但是困難依然存在：由于三組分的設計，PROTAC分子的分子量通常較大（~1000），違反業界所接受的成藥性規律如成藥性五之原則，屬于傳統意義上不能成藥的分子空間，滲透性，口服PK極具挑戰性。
圖片摘自：Churcher, I. J. Med. Chem. 2018, 61, 444.
在20年后的今天，PROTAC技術已經成為小分子藥物研發的熱點領域。傳統小分子藥物抑制劑的活性是占位驅動。而PROTAC化合物的活性由于這樣一個全新的降解機理，是事件驅動。一旦靶點蛋白降解完成，PROTAC分子又可以周而復；始地進入降解靶點蛋白的循環。相對于傳統小分子藥物和生物大分子藥物，PROTAC藥物可以兼二者之長免二者之短，會有這樣的潛在特性：高活性，高選擇性，可以口服，全身系統性分布，類似催化劑的作用，可能只需要較低的臨床劑量。設計PROTAC化合物不需要靶點蛋白的抑制劑，只需要能夠和靶點蛋白結合的配體。由于鏈接部分也會參與形成三元復合物、貢獻結合能，和靶點蛋白結合較弱地配體也有可能形成降解活性很高的PROTAC分子。這一系列特性使得PROTAC有可能靶向那些“不可成藥靶點”，完成以前傳統小分子藥物無法完成的任務。在2013年Crews教授成立了專注于開發PROTAC靶向蛋白降解技術的Arvinas公司。學界和工業界的合力促進了這個技術和PROTAC藥物的快速發展。Arvinas開發的靶向AR和ER的口服PROTAC藥物已經在臨床上達成了口服PK,安全性，初步藥效的概念驗證。Arvinas在2018年挾臨床前階段的PROTAC產品管線就成功上市充分顯示了資本界對這一革命性創新技術的認可和期待。在IPO近4年后的今天，Arvinas公司市值已暴漲7倍。緊隨Arvinas，專注于蛋白降解技術的初創公司Kymera,C4,Nurix等都是以臨床前的產品管線就成功上市。各大藥企也競相布局靶向蛋白降解領域，紛紛和這些初創公司合作。最近的一個合作是2021年7月美國醫藥巨頭輝瑞公司和Arvinas達成共同開發ER降解劑ARV-471的協議：輝瑞將支付高達24億美元的頭款、股權投資和里程碑付款，雙方共同開發ARV-471并平分未來的銷售收入。迄今擁有臨床階段PROTAC產品管線的公司及產品管線如下表所示。
雖然Arvinas仍然是PROTAC領域的領頭羊，但是中國的藥企正在迎頭趕上。尤其是在更具挑戰性的口服PROTAC產品管線上已有三家中國藥企殺入競爭的前沿，躋身口服PROTAC領域的第一梯隊。老牌上市藥企海思科和創新藥物龍頭企業百濟神州不約而同地布局了BTK PROTAC。而專注于腫瘤尤其是前列腺癌以及代謝類疾病的Bio-tech企業海創藥業異軍突起，基于其在前列腺癌領域的深度布局而開發了AR PROTAC。在前列腺癌領域，靶向難以成藥的AR剪切突變體以治療耐藥性前列腺癌，一直是未滿足的臨床需求，其攻克極具挑戰性。Arvinas已向這個目標努力多年。海創藥業迎難而上也在開展這個方向的PROTAC研究。且看最后誰能在這個方向取得突破。
從黃金時代出發，走向更深廣的未來：PROTAC臨床轉化爆發點預測
PROTAC領域的挑戰性依然存在，但是隨著ARV-110,ARV-471,KT-474等一系列化合物的臨床數據的披露，PROTAC這一革命性治療手段已經得到了在人體上的概念驗證（Proof of concept）:口服PK是可以達到的，PROTAC化合物可以是安全的，靶向蛋白降解和初步藥效是可以達到的。留給研究者的問題更多的是如何發現更好的PROTAC分子。
經過近20年的積累，人們對PROTAC化合物的分子設計，構效關系，口服PK等都有了更深刻的理解。新的技術如計算化學，AI助力的藥物發現，DEL化合物庫都可能加速PROTAC藥物的發現和開發。隨著這些PROTAC臨床產品管線的不斷推進，臨床優勢的不斷凸顯，PROTAC技術勢必迎來一個蓬勃發展的新時代。讓我們回到Crews教授的這篇綜述。PROTAC技術在接下來的20年里將會如何發展？Crews教授在這篇綜述指出了4個臨床轉化的爆發點：● 在臨床上驗證分子膠和PROTAC之外的靶向蛋白降解模式。
目前進入臨床的蛋白降解藥物主要是靶向于已經驗證過的成熟靶點。這一策略可以驗證蛋白降解技術作為一種新的治療模式可以通過降解靶點蛋白發現“同類最佳“的藥物。但是蛋白降解技術更大的價值在于靶向那些難成藥靶點，甚至是那些尚未觸及的新靶點。
圖片摘自：Bekes, M.; Langley, D. R.; Crews, C. M. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat. Rev. Drug Discov. 2022, ahead of print.
PROTAC只需要和靶點蛋白有結合作用，而不一定要結合在活性位點。因此PROTAC可以比傳統的抑制劑有更多的靶點選擇。更適用于PROTAC蛋白降解技術的靶點包括：偏離正常狀態的蛋白，如過表達，基因突變，聚集，以及表達/分布偏差產生獲得性功能的致病蛋白。還有那些進化出耐藥突變的蛋白，具有骨架功能的蛋白，以及現有手段無法靶向的難成藥蛋白都適用于PROTAC蛋白降解技術。PROTAC的靶點蛋白需要在蛋白表面有一個E3連接酶可以接近的結合位點，并且有一個無結構區域可以被牽引進入蛋白酶體進行降解。人體有近600種E3連接酶可供探索，但目前進入臨床的PROTAC化合物只利用了CRBN和VHL兩種E3連接酶。問題不在于“是否”能有基于新的E3連接酶的蛋白降解藥物進入臨床，而是“何時”和治療“何種疾病”。盡管現有的CRBN和VHL E3連接酶已經成功地被應用于靶向蛋白降解技術，開發新的E3連接酶還是很有必要。尤其是在腫瘤領域，一個新的藥物應用后很快就可能產生耐藥性。如果僅僅依賴于現有的兩三種E3連接酶來開發蛋白降解藥物，就有理由擔心腫瘤突變產生針對這幾種E3連接酶的耐藥性。那么何處去尋找新的連接酶，何種連接酶適用于開發PROTAC藥物呢？一種比較實際的途徑是跟進那些更類似于CRBN和VHL，廣泛存在又廣泛適用的連接酶。這樣的連接酶可以沒有限制地和所選擇的靶點蛋白匹配，又可以適用于不同的疾病領域。不同的連接酶可能導致不同的降解活性。而這種差異可以歸因于幾個方面：靶點蛋白和連接酶形狀的匹配度，連接酶和靶點蛋白形成有降解能力的三元復合物的能力，在亞細胞層面靶點蛋白合的位置和連接酶的位置相匹配的差異，靶點蛋白和連接酶在特定類型細胞中的表達程度。近來橫空出世的源自Google/DeepMind和RoseTTAFold的AI驅動的三元復合物結構預測模型將助力針對尚未觸及的靶點和連接酶的計算機輔助藥物發現。組織和細胞特異性的連接酶可以提供開發具有針對性的蛋白降解藥物的機會。學術界和工業界都對發現具有獨特蛋白表達特性的連接酶有濃厚的興趣。這樣可以引發組織特異性和細胞特異性的精準靶向蛋白降解（pTPD）-蛋白降解領域最令人興奮的課題之一。特異性高表達的連接酶可以用來降解靶點蛋白，實現藥效。而特異性低表達的連接酶則可以用于降低毒性，提高安全性。在疾病組織和細胞中富集的連接酶是另一個精準靶向蛋白降解的研究前沿。很多時候腫瘤組織對一種連接酶的富集同時對這種連接酶產生依賴。這種關系可以通過分析不同腫瘤細胞中E3連接酶的CERES得分而得到。這些連接酶的優勢在于腫瘤細胞會更難于產生針對連接酶的耐藥性。不過這類的連接酶可能不一定會有安全性上的優勢。
雖然目前上市的IMiD分子膠類蛋白降解劑和臨床階段的PROTAC類蛋白降解劑都集中于腫瘤領域，既然蛋白降解劑有可能降解任何選定的靶點蛋白，靶向蛋白降解的治療領域正在超越腫瘤領域。炎癥，免疫和免疫腫瘤是一個方向。例如Nurix的BTK降解劑和Kymera的IRAK4降解劑還可能治療免疫-炎癥疾病，例如類風濕關節炎。緊隨免疫療法的步伐，小分子介導的通過激活免疫應答來治療腫瘤是新藥研發的重點領域。PROTAC有可能通過降解PD-1/PD-L1而成為免疫腫瘤領域靶向免疫細胞活化的first-in-class小分子藥物。神經學和神經退行性病變是另一個可能拓展的疾病領域。一些神經退行性疾病涉及某些蛋白的積累而產生的毒性。這樣的蛋白包括Tau，α-synuclein, huntingtin (mHTT）突變體，TAR RNA結合蛋白 (TARDBP, 或稱TDP43) 還有FUS RNAbindi（FUS）。PROTAC化合物可以應用其降解蛋白的功能清除這些致病蛋白。Tau蛋白病變是一個小分子抑制劑失敗而PROTAC可能成功的疾病案例。現在更有待回答的病理學問題不是能否降解Tau蛋白，而是降解Tau蛋白是否能治療老年癡呆（AD），還有降解Tau蛋白時是否需要顧及其寡聚狀態。應用PROTAC抗病毒也是另一個可以拓展的疾病領域。至少有20多種病毒被發現劫持人體的泛素蛋白-蛋白酶體系統來促進病毒的生存和自我復制。這個現象曾經激發了靶向蛋白降解概念的產生。現在是時候形成一個閉環，把靶向蛋白降解回饋到病毒上去。抗病毒PROTAC的可行性最早是在降解丙肝病毒（HCV）的NS3/4A蛋白中得到證實。
目前針對新冠病毒的PROTAC正在緊密研究中。小分子抗病毒藥物的靶點蛋白，如Mpro,PLpro和Rdrp也是抗病毒PROTAC的可能靶點。正在進行臨床試驗的小分子新冠藥物為抗新冠PROTAC提供了出發點。Nurix也公布了有三款靶向新冠的降解劑正在研究中。PROTAC分子結構設計的思路激發了多種另類PROTAC模式的產生。作者把PROTAC定義為三類：PROTAC應用傳統小分子配體，bioPROTAC應用多肽配體，hybridPROTAC應用肽-小分子的雜化彈頭。由靶向泛素蛋白-蛋白酶體的PROTAC衍生出了靶向自噬體的AUTAC，自噬體牽引的ATTAC,靶向溶酶體的LYTAC,基于抗體的AbTAC等多種新的蛋白降解模式。BioPROTAC除了應用多肽之外，還應用融合蛋白，寡核苷酸作為靶點蛋白的配體。這類bioPROTAC有潛力成為新的治療模式，同時其投送和給藥還有困難有待解決。這些另類PROTAC的特性被總結在下表中。
二十年彈指一揮間，PROTAC由2001年的一個充滿創意但困難重重的概念到現在多個化合物進入臨床開發，從飽受質疑到現在小分子藥物研發的熱點前沿，從一個學術課題組的寂寞前行到現在多家上市公司的多方賽跑，Crews教授對靶向蛋白降解領域做出了巨大貢獻。現在PROTAC靶向蛋白降解技術已經在臨床上完成了概念驗證，各種衍生的蛋白降解技術紛紛出現，在生物醫藥領域的應用潛力不斷地被挖掘出來。首批進入臨床的PROTAC藥物通過靶向成熟靶點驗證了PROTAC的概念和并具備了成為“best-in-class”藥物的潛力。在未來的20年里，PROTAC技術有望在難成藥靶點和全新靶點上實現“first-in-class”的突破。The past is prologue.未來的20年必然是PROTAC技術蓬勃發展，成果爆發的20年。我們拭目以待國內的藥企如何抓住機會，大膽布局，加力耕耘，去成就世界領先的靶向蛋白降解藥物，服務世界的患者。
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