免疫沉淀 ( IP ) 是指從細胞/組織/血液混合物中富集純化其特異性的靶標或抗原。

免疫共沉淀( CoIP ) 指用抗體用于從混合樣品中富集純化其靶抗原及其結合蛋白。在這種情況下，抗原是誘餌蛋白，而其結合蛋白是通過抗體--抗原相互作用共同純化的相互作用的蛋白。

通常利用Co-IP實驗可以

（1）測定兩種甚至更多種蛋白質是否在體內結合；

（2）鑒定一種特定蛋白質的作用搭檔；

（3）分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。

因此，如何簡潔并有效的設置分組來明確蛋白間是否互作是CO-IP實驗的關鍵因素之一。

一個成功的Co-IP實驗，首先得證明靶蛋白A和預測的相互作用的蛋白B存在于蛋白質樣品中，所以抽出來的蛋白樣品要直接檢測一下A和B的存在，這個一般稱為Input。

然后要證明IP抗體是不是能拉下來靶蛋白，所以做完IP后要檢測一下靶蛋白。我們需要注意，western的一抗未必能作為IP抗體去捕獲靶蛋白，因為western檢測時，蛋白是變性的狀態，空間結構都打開了。很多抗體在制備時使用的是合成的肽段作為抗原，這樣的抗體不一定能識別非變性狀態下折疊起來的目的蛋白。所以選IP抗體時一定要注意抗體的介紹上提到的應用（類似ChIP, Flow Cyt, ICC/IF, IHC-P, IP, WB等），而且即使購買的抗體說是可以用于IP的，其在不同樣品中的效果還是需要實際檢測效果。

如果靶蛋白A沒有檢測到，那么可能有如下幾種原因：

要么IP抗體有問題，這個就要換不同的抗體試了，要么beads沒有結合上IP抗體，這個倒是可以通過WB來檢測是否包被好。一般常用的抗體大部分是鼠源或者兔源，WB時候通過重鏈/輕鏈即可判定beads是否偶聯上抗體。也有可能是蛋白A表達水平過低，這種情況可以加大樣品量。

如果內源性 Co-IP，Input也沒有檢測出來，這種情況可能是樣品本身靶蛋白含量太低或者蛋白提取沒有做好，當然，抗體原因也不容忽視。所以我們一般情況可以先嘗試做過表達的Co-IP。

IP后A、B蛋白都能檢測到，固然是值得高興的，但是這結果是不是假陽性呢？還得做個陰性對照，目前文獻中常提到有幾種方法：

（1）只加入beads不加入IP抗體

（2）加入一種不相干的蛋白的抗體作為IP抗體

（3）加入正常IgG作為IP抗體

（4）使用不表達靶蛋白A但表達B的蛋白樣品做對照。

另外，CO-IP（免疫共沉淀）一般分為內源性和外源性，我們可以簡單理解為內源性CO-IP是檢測細胞本身含有的蛋白A和蛋白B互作有無；外源性CO-IP是將蛋白A和蛋白B在細胞內過表達后，再檢測二者互作有無。

對于內源性Co-IP實驗，如果出現陰性結果，也有可能是蛋白在細胞內表達過低導致，這種情況也可以先做過表達Co-IP作為對照。

只有設置了正確的對照，出來的結果才是可以被合理解釋的，也是被認可的。

首先，我們了解相關名稱

IB：即immunoblotting（免疫印跡）也就是常規的WesternBlotting，用于檢測目的蛋白。

IP：即immunoprecipitation（免疫沉淀）這一步主要是為了純化富集目的蛋白。

Input：全細胞裂解液，可認為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細胞樣品，在做IP實驗之前，需要預留Input，在檢測IP的結果同時確認樣本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體

IgG：Anti-A的同型對照抗體，即跟Anti-A同種屬來源，如Anti-A是鼠源IgG型，則同型對照抗體需要選擇Mouse IgG

目前我們常用以下幾種分組方式：

1、內源性CO-IP檢測

上面示意圖分為兩大部分：IP 部分和 Input 部分。

首先看Input 部分，通過分別檢測蛋白A和蛋白B表達水平，我們可以確認：

1組（IgG組）和2組（Anti-A組）中蛋白A、蛋白B均有表達，并且表達量一致，排除了因部分組別部分蛋白表達缺失、不同組蛋白表達量差異化大等原因造成的假陰性或者假陽性。

然后我們再看IP部分：

“IB:A”結果顯示我們1組（IgG組）不結合蛋白A ，2組（Anti-A組）可以特異性富集蛋白A。

“IB:B”結果顯示我們IgG組沒有非特異性結合，Anti-A組通過特異性富集蛋白A進而拉下蛋白B，即提示我們蛋白A和蛋白B可形成復合物，存在互作。

IP部分的“IB:A”這一步檢測很關鍵，可以明確的告訴我們蛋白A已經被我們通過免疫沉淀方法成功的特異性識別并富集到了磁珠/凝膠上，也就是說免疫沉淀的實驗操作已成功。而下一步能否檢測到蛋白B，主要是由兩者是否存在互作決定的，當然，蛋白表達量低，需要某種刺激條件等因素也會影響蛋白B能否被檢測到.

2、外源性CO-IP檢測

上圖結果同樣分為兩大部分：IP 部分和 Input 部分。外源性一般我們不需要設置IgG組（陰性對照），可以利用空載等方式設置陰性對照組。

首先看Input 部分，通過分別檢測HA和Flag表達水平，我們可以確認：

A-Flag和B-HA過表達后都能被檢測到，并且表達量一致，排除了因樣品量不均勻、樣品組分缺失等原因造成的假陰性或者假陽性。

然后我們再看IP部分，“IB:Flag ”結果顯示1、3組通過IP:Flag可以特異性識別Flag標簽并富集蛋白A。“IB:HA”結果顯示1、2對照兩組沒有拉下蛋白B，第3組通過特異性富集蛋白A進而捕獲蛋白B，即提示我們蛋白A和蛋白B可形成復合物，存在互作。

“IP:Flag   IB:Flag ”這一步也是為了明確免疫沉淀特異性識別并利用磁珠/凝膠富集蛋白A的實驗過程是成功的。

當然我們也有小伙伴選擇以下分組方式

本實驗一共分為兩大組：Input部分及IP部分。

其中IP組又分為IgG組（陰性對照組）和實驗組，并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。

由Input組得到結論：蛋白A與蛋白B都是存在的，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。這也提示：本實驗一般是選取同一份細胞樣品，提前取出部分做Input,其余均分為兩份即IgG組（陰性對照組）和實驗組。

我們繼續看IP部分：2組（IgG組）結果顯示，蛋白A與蛋白B均沒有條帶，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結合，同時排除了蛋白與抗體非特異性結合的可能性；而實驗組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進行免疫沉淀，富集了蛋白A，同時蛋白B也被拉下來，即提示我們蛋白A和蛋白B可形成復合物，存在互作。

以上只是我們舉了幾個比較常用的例子，設置不同對照組的最終目的就是為了讓實驗組簡潔有效的得出確定的結果。所以各位小伙伴可以根據自己實際情況選擇最優方案。

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劃重點：

Biolinkedin整理了《nature》《science》《cell》及其子刊部分文獻中CO-IP數據，分享出來供大家參考。

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